| 摘要 |
Método para identificar secuencias de ADN desconocidas cercanas a secuencias de ADN conocidas, con el que puede mejorarse la precisión, la sensibilidad y la reproducibilidad de la determinación de las secuencias de ADN desconocidas que rodean las secuencias de ADN conocidas. Método de alto desempeño con el que pueden identificarse rápida y eficientemente las secuencias cromosómicas cercanas a los transgenes en el genoma de las plantas. Mediante el análisis de estas secuencias desconocidas, es posible determinar el sitio en el que se han insertado los transgenes e identificar las redistribuciones, las inserciones o las supresiones que se hayan producido como resultado del proceso de inserción. Además, a través del análisis de las secuencias cromosómicas circundantes, es posible determinar la localización de los transgenes en los cromosomas.Reivindicación 1: Un método para determinar la secuencia de un polinucleótido desconocido adyacente a un polinucleótido conocido en una molécula de ADN asilada, caracterizado porque comprende a) digerir el ADN aislado que contiene una porción o la totalidad de la secuencia del polinucleótido conocido y la secuencia del polinucleótido desconocido adyacente con una o más enzimas de restricción apropiadas, con el propósito de producir una pluralidad de fragmentos de los polinucleótidos que han sido digeridos por las enzimas de restricción; b) sintetizar una cadena complementaria de los fragmentos de los polinucleótidos que han sido digeridos por las enzimas de restricción, para lo cual puede emplearse un oligonucleótido cebador con una secuencia que tiene un agente de unión en su extremo 5’; c) aislar la cadena complementaria sobre la base de la unión del agente a una matriz de aislamiento apropiada, para luego separar la cadena complementaria de los fragmentos de los polinucleótidos que han sido digeridos por las enzimas de restricción; d) unir un adaptador de cadena simple a la cadena complementaria aislada unida a la matriz de restricción, de manera tal de obtener una cadena complementaria aislada unida; e) llevar a cabo una primera reacción de amplificación basada en una PCR con la cadena complementaria aislada unida, mediante el uso de un primer cebador diseñado para que se una a la secuencia del polinucleótido conocido y un segundo cebador diseñado para que se una al adaptador de cadena simple, con el objeto de producir un primer amplicón a través de la PCR; f) llevar a cabo una segunda reacción de amplificación basada en una PCR con el primer amplicón, de modo de amplificar una secuencia interna en él y generar un segundo amplicón; y g) secuenciar el segundo amplicón para determinar si comprende la secuencia de polinucleótido desconocido. |
