一种高效生产Trx-hCTRP2的方法

摘要

本发明公开了一种高效生产Trx-hCTRP2的方法，该方法主要包括以下步骤：克隆人hCTRP2基因，构建原核表达载体：表达载体pET32-a(+)和质粒hCTRP2/pMD20-T经过XhoI及BamH I双酶切并纯化回收，并利用T4DNA连接酶连接，得重组载体pET32/hCTRP2，转化重组载体到大肠杆菌宿主中，可溶诱导表达；纯化。本发明所述生产方法，利用pET32作为载体、优化组合诱导表达条件，最终可高效表达可溶hCTRP2融合蛋白的方法，既保证了hCTRP2融合蛋白的生物学活性也高效地获得了大量稳定蛋白。

主权项

一种生产重组人补体C1q肿瘤坏死因子相关蛋白‐2（hCTRP2）的方法，其特征在于：主要包括以下步骤：（1）克隆hCTRP2基因：以从人脂肪细胞中提取的总mRNA为模板，先用RT‑PCR扩增总cDNA，再以该cDNA为模板，用特异引物扩增出完整hCTRP2基因片段，所用hCTRP2特异引物中上游引入BamH I酶切位点和下游引入Xho I酶切位点，回收PCR产物连接到质粒pMD20‑T载体，得质粒hCTRP2/pMD20‑T，经过测序确定为正确表达序列；（2）构建原核表达载体：将表达载体pET32‑a（+)和质粒hCTRP2/pMD20‑T经过Xho I及BamH I双酶切并纯化回收，并利用T4DNA连接酶连接，得重组载体pET32/hCTRP2；（3）转化重组载体到大肠杆菌宿主中：将重组载体pET32/hCTRP2转化到大肠杆菌TOP10菌株中，再从TOP10中提取重组载体pET32/hCTRP2；用热激法将重组载体pET32/hCTRP2转入到大肠杆菌表达菌株BL21（DE3）中，LB Amp抗性平板筛选得到包含有重组质粒pET32/hCTRP2的大肠杆菌表达菌株转化子；（4）可溶诱导表达：得到的大肠杆菌重组转化子在37℃培养至OD600为0.45－0.65时加入浓度为0.2mM—0.5mM的IPTG，37℃诱导4‑10h，诱导表达重组蛋白体；（5）利用镍亲合层析和分子筛的方法对hCTRP2蛋白进行纯化，得到了高纯度的hCTRP2可溶蛋白。