一种4-1BBL蛋白的制备方法

摘要

本发明提供了一种4-1BBL蛋白的制备方法，所述方法是采用小鼠4-1BBL(TNFSF9，NP_033430.1)胞外段蛋白的cDNA以基因工程方法制备含206个氨基酸残基(Arg 104-Glu 309)的重组4-1BBL蛋白。采用本发明方法，可大量获得4-1BBL蛋白，大大提高了蛋白得率，获得的4-1BBL胞外段蛋白可以应用于制备对4-1BBL蛋白定量的临床前研究试剂盒或药用，应用前景广阔。

主权项

一种4‑1BBL蛋白的制备方法，所述方法包括：（1）取含4‑1BBL蛋白的小鼠淋巴细胞，conA体外刺激培养后经trizol裂解，抽提得到mRNA；（2）将mRNA逆转录得到4‑1BBL胞外段蛋白的cDNA；（3）对步骤（2）所得cDNA进行PCR扩增，得到4‑1BBL蛋白目的基因；PCR扩增引物为：上游引物：5’‑CTC GAG AAA AGA AGA ACC GAG CCA AGA CCT‑3’，下游引物：5’‑GAA TTC TTC CCA TGG ATT ATC AGG‑3’；（4）将步骤（3）PCR产物用Xho I和EcoR I双酶切后定向插入经同样双酶切的ppic9，获得重组质粒ppic9‑4‑1BBL；（5）将重组质粒ppic9‑4‑1BBL转化至大肠杆菌DH5α，经培养扩增、抽提纯化、测序分析，获得测序正确的重组质粒；所述重组质粒ppic9‑4‑1BBL序列如下：CTC GAG AAA AGA AGA ACC GAG CCA AGA CCT GCA TTG ACC ATT ACT ACT TCT CCA AAC TTG GGT ACA AGA GAA AAC AAC GCT GAC CAG GTC ACT CCA GTT TCT CAC ATC GGA TGT CCA AAC ACC ACC CAG CAG GGA TCT CCT GTT TTT GCT AAG TTG TTG GCC AAA AAC CAG GCT TCT TTG TGT AAC ACT ACC TTG AAC TGG CAC TCT CAA GAC GGT GCC GGT TCT TCT TAC TTG TCT CAG GGT TTG AGA TAC GAG GAG GAC AAG AAG GAG TTG GTC GTC GAC TCT CCT GGA TTG TAC TAC GTC TTT TTG  GAG TTG AAG TTG TCT CCA ACA TTC ACC AAC ACT GGA CAC AAG GTT CAG GGA TGG GTT TCT TTG GTT TTG CAG GCT AAG CCA CAG GTT GAC GAT TTC GAC AAT TTG GCC TTG ACT GTC GAA TTG TTC CCT TGC TCT ATG GAA AAC AAA TTG GTC GAC AGA TCT TGG TCT CAA TTG TTG TTG TTG AAG GCC GGA CAC AGA TTG TCT GTC GGA TTG AGA GCA TAC TTG CAT GGT GCA CAA GAC GCT TAC AGA GAC TGG GAG TTG TCT TAC CCT AAC ACC ACT TCT TTC GGT TTG TTC TTG GTT AAA CCT GAT AAT CCA TGG GAA GAA TTC；（6）将测序正确的重组质粒转化至甲醇酵母菌，诱导表达重组蛋白；（7）将表达重组蛋白的活化菌株进行诱导发酵培养，发酵液离心，取上清液分离纯化，得到纯化的4‑1BBL重组蛋白。