一种抗禽流感的功能性饲料添加剂的制备方法

摘要

一种抗禽流感的功能性饲料添加剂的制备方法，将人工合成H5N1亚型禽流感病毒血凝素基因的部分片段和真核表达载体pBI-221连接获得重组质粒，通过基因枪、电转化等转化方法将获得的重组质粒转化入杜氏藻细胞，使血凝素在杜氏藻细胞中表达，制备得到表达病毒蛋白亚单位的工程藻；将制备的工程藻细胞进行开放式扩大培养后，收集藻体，然后经低温干燥、制粒等加工工艺过程，得到一种抗禽流感的功能性饲料添加剂。本发明所制备的饲料添加剂应用于禽类养殖业具有抗禽流感的免疫保护作用，能够提高禽类机体的免疫力和生长速度，并且无任何毒副作用，生物安全性好。

主权项

一种抗禽流感的功能性饲料添加剂的制备方法，其特征在于：其具体步骤为：步骤一、工程藻的制备（1） H5N1禽流感血凝素基因的制备：根据GenBank中登录的H5N1亚型禽流感病毒的血凝素基因序列，人工合成血凝素基因的部分片段，其基因序列如序列表序列1，然后采用PCR的方法对该基因片段进行扩增；PCR的上游引物为p1：5’TCTAGAATGCGCAGCATGTCCATACCATA3’，下游引物为p2：5’GAGCTCAATGTGGATTCTTTGTCTGC 3’， 下划线所指为上下游引物分别引入的Xba I和Sac I酶切位点；PCR 的扩增体系如下：5μl 10×PCR buffer，3μl 浓度为25mmol/L MgCl2，2μl浓度为25mmol/L dNTP，浓度为25μmol/L p1和 p2引物各2μl，基因模板 2μl，1μl浓度为 5U/μl Taq酶，补加无菌水至终体积50μl；RT‑PCR反应参数为：94℃预变性3min，94℃变性30S，50℃退火30S，72℃延伸60S，共计30个循环，然后72℃延伸10min，4℃终止反应；（2）真核表达载体的pBI‑HA构建：将鉴定正确的血凝素基因片段进行Xba I和Sac I双酶切，然后采用胶回收试剂盒回收血凝素基因片段片段；将真核载体pBI‑221进行Xba I和Sac I双酶切，同样进行胶回收载体片段；然后通过T4连接酶连接血凝素基因片段和真核表达载体pBI‑221，将连接体系转化入大肠杆菌感受态，挑选阳性菌落培养后进行质粒的提取，采用Xba I和Sac I进行双酶切鉴定血凝素基因片段是否成功构建入真核表达载体中，得到正确的pBI‑HA重组质粒，备用；基因片段和载体片段按照下列体系建立连接反应：3 μl 10× Ligation Buffer，1 μl pBI‑221载体，8 μl HA基因片段，1 μl T4 DNA Ligase，补加ddH2O至终体积30 μl；连接体系于16℃水浴放置过夜；（3）利用电转化法将重组质粒转化杜氏藻细胞：将鉴定正确的重组质粒通过基因枪、电转化等转化方法将重组质粒转化入杜氏藻细胞；通过对转基因细胞的筛选，结合分子生物方法的鉴定，得到表达禽流感病毒亚蛋白单位的工程藻细胞；步骤二、工程藻的扩大培养将步骤一制备的表达禽流感病毒亚蛋白单位的工程藻细胞接种到15L玻璃瓶中进行扩大培养，当细胞生长至对数生长期时，按1%的接种量接种于天然海水的藻类养殖场，进行规模化的生产培养，培养约10‑14天，细胞的浓度增加为106个/ml；步骤三、工程藻的收集和加工处理当工程藻细胞生长至106个/ml 时，对藻类细胞进行收集；可以采用静止沉降或离心沉降法，批量的收集藻体；收集后的藻体经过低温干燥、制粒或与其它营养成分混合加工后，得 到一种抗禽流感的功能性饲料添加剂。