一种采用固定化酶制备L-鸟氨酸的方法

摘要

一种采用固定化酶制备L-鸟氨酸的方法。采用构建的精氨酸酶基因工程菌BL21(DE3)-pET35b-Arg，将其诱导表达，破碎细胞，收集上清液，对精氨酸酶的最适反应条件和固定化条件进行了研究。将自制的纤维素微球载体加入到细胞裂解液中，通过CBD的特异性吸附，实现精氨酸酶的固定化，采用交联剂交联之后，优化催化反应条件，最佳的催化反应条件为，pH8；反应时间2h；底物L-精氨酸浓度，40g/L；固定化酶浓度，2mL/L；Mn2+浓度，1mM。在最适反应条件下，重复使用10次，底物L-精氨酸的转化率均达到90%以上。

主权项

一种采用固定化酶制备L‑鸟氨酸的方法，其特征在于该方法包括：以固定化的重组表达的精氨酸酶为酶源，以L‑精氨酸为底物，在25至50℃下，pH值为6至11，经酶法转化反应0.5至5h，在0.1至10mM Mn2+存在的条件下，在每升催化反应液中底物L‑精氨酸加入量为10至50g，固定化酶0.5mL至5mL，产生L‑鸟氨酸，进一步分离获得L‑鸟氨酸；或在相同条件下，以DL‑精氨酸为底物，拆分20至80g/L的DL‑精氨酸制备D‑精氨酸和L‑鸟氨酸；所述重组表达的精氨酸酶来自构建的基因工程菌株大肠杆菌BL21(DE3)‑pET35b‑Arg1的细胞裂解液，重组菌株中的表达载体为pET35b‑Arg1重组表达载体，具体构建方法是：以小鼠肝脏mRNA反转录制备的cDNA为模板PCR扩增精氨酸酶Arg1基因，连接入pET21a(+)中构建pET21(+)‑Arg1表达载体，转化大肠杆菌BL21(DE3)中后诱导表达确认Arg1活性，随后将该基因酶切后连接入pET35b中构建pET35b‑Arg1载体，转化至大肠杆菌BL21(DE3)中并诱导表达确认Arg1活性后，命名BL21(DE3)‑pET35b‑Arg1；重组菌体细胞中表达有融合蛋白纤维素结合域‑精氨酸酶；所述的固定化重组表达的精氨酸酶是以基因工程菌株大肠杆菌BL21(DE3)‑pET35b‑Arg1的细胞裂解液为起始酶源，经过粒径大小为5～100微米的纤维素微球吸附，完成固定化，得到固定化的重组表达的精氨酸酶。