一种测定β-葡聚糖合成酶活力的方法

摘要

本发明公开了一种测定β-葡聚糖合成酶活力的方法，本发明的优点是以葡萄糖作为酶促反应底物、用3,5-二硝基水杨酸作为显色剂对β-葡聚糖合成酶合成β-葡聚糖后消耗的葡萄糖的量在可见光下进行检测来确定β-葡聚糖合成酶的活力。该方法与传统的使用UDP-[14C]葡萄糖为底物、通过使用液体闪烁计数仪测定UDP-[14C]葡萄糖的放射活性的变化来测定β-葡聚糖合成酶的活力的方法相比，可以大幅度降低实验成本，而且该方法不使用含有放射性的葡萄糖作为底物，实验的安全性高。本方法灵敏度高，操作简单安全，方便快捷，便于大规模推广应用。本发明可广泛用于糖类与酶类产品的研究与开发中。

主权项

一种测定β‑葡聚糖合成酶活力的方法，包括以下工艺步骤：（1）制样——β‑葡聚糖合成酶溶液的制备    准确称取1.0‑5.0g β‑葡聚糖合成酶，加入50‑100ml 7.0 mmol/L NaH2PO4, 7.0 mmol/L Na2HPO4, pH = 6.8的磷酸盐缓冲液搅拌使其溶解，样品的最终浓度为0.01g/ml‑0.1g/ml，4℃保存备用；（2）葡萄糖标准溶液的配制    精确称取100mg无水葡萄糖，加蒸馏水定容至100ml，得到浓度为1.0mg/ ml的葡萄糖标准溶液；（3）DNS溶液的配制    称取3,5‑二硝基水杨酸3.15g，加水500ml，搅拌溶解，水浴至45℃；然后逐步加入100ml 0.2g/ml的氢氧化钠溶液，同时不断搅拌，直到溶液清澈透明；再逐步加入四水酒石酸钾钠91.0g、苯酚2.50g和无水亚硫酸钠2.50g；继续45℃水浴加热，同时补加水300ml，不断搅拌，直到加入的物质完全溶解，停止加热；冷却至室温后，用蒸馏水定容至1000 ml，过滤，取滤液，储存于棕色瓶中，避光保存；室温下存放7d后可以使用，有效期为6个月；（4）葡萄糖溶液标准曲线的制作    分别取6‑15组具有不同浓度的葡萄糖标准溶液2.0ml，浓度范围在0‑500μg/ml之间，加入DNS试剂1.5ml，沸水浴加热5‑20min，取出冷却，加入蒸馏水定容至25ml后于波长510‑570nm处测定光密度值；每个浓度做三个平行样；以上加量可按比例增减；根据每组葡萄糖浓度与测得的光密度值之间的关系，以葡萄糖浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，绘制标准曲线；（5）β‑葡聚糖合成酶的活力单位    β‑葡聚糖合成酶的活力单位U被定义为：每分钟消耗1μg葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位；比活力U/mg定义为单位酶蛋白具有的酶活力单位；（6）β‑葡聚糖合成酶的比活力的计算β‑葡聚糖合成酶的比活力计算公式： X= W/(T×M)     式中：X——酶的比活力，单位，U/mg；W——反应掉的葡萄糖的质量，μg；T——反应时间，min；M——待测样品的质量，mg或待测样品的体积，ml；（7）β‑葡聚糖合成酶活力的测定    将终浓度为1‑5mg/ml的预热至测定温度的葡萄糖溶液加入到预热至相应温度的β‑葡聚糖合成酶溶液中开始合成反应，反应温度为10‑40℃，反应时间为60min以内，将该酶促反应液与1.5ml的DNS溶液迅速混合后于沸水中加热5‑20min，取出冷却，加入蒸馏水定容至25ml后于波长510‑570nm处测定光密度值，根据步骤（4）制作的葡萄糖浓度与相应光密度值之间的标准对应关系曲线确定待测β‑葡聚糖合成酶在合成β‑葡聚糖反应中单位时间内所消耗的葡萄糖的含量，代入步骤（6）中β‑葡聚糖合成酶的比活力的计算公式，计算出β‑葡聚糖合成酶的活力。