一种检测普洱茶微生物群落结构的方法

摘要

本发明公开了一种检测普洱茶微生物群落结构的方法，该方法用玻璃珠震荡法收集普洱茶茶叶的微生物菌体；然后用液氮冻融、酶法和CTAB法相结合提取微生物总DNA；再分别使用细菌16S rRNA和真菌18S rRNA 可变区域的通用引物对提取的基因组DNA进行PCR扩增；用DGGE分离PCR产物和染色得到条带图谱，应用Quantity One软件对条带进行相对定量分析；切胶回收条带DNA，对回收的核酸进行PCR扩增，产物连接T载体，挑选阳性克隆进行带GC夹的菌落PCR；DGGE电泳重新比对，选择目的条带对应的PCR产物进行测序鉴定。本发明可用于检测普洱茶发酵过程中微生物群落结构和相对数量的变化。

主权项

一种检测普洱茶微生物群落结构的方法，其特征在于包括如下步骤：1)玻璃珠震荡法收集茶叶样品的微生物菌体；2)用液氮冻融、酶法和CTAB法相结合的方法提取茶叶上的微生物菌体总DNA：600μL细胞裂解液充分悬浮菌体沉淀，在液氮和65℃水浴锅中反复冻融4‑6次，37℃水浴10min；加入30μL溶菌酶，37℃水浴30min；加30μL SDS溶液，6μL蛋白酶K，37℃水浴1～2h；于通风橱中加660μL的氯仿/异戊醇的混合液，所述氯仿/异戊醇的混合液中氯仿与异戊醇的体积比为24∶1；于冰上放置5min，12000rpm离心5min，将上清液转移到新的无菌离心管中，直至上清液清澈透明，最后将上清液转入1.5mLEP管中；加入异丙醇和乙酸钠溶液，按体积比计算，所述的异丙醇和乙酸钠溶液体积分别为为上清液体积的0.6～0.8倍和0.1倍；轻轻混匀，于‑20℃沉淀30min以上；12000rpm，离心5min，弃上清，加入1mL预冷的70％乙醇，12000rpm，离心5min，弃上清；自然风干沉淀，加入20～40μLTE溶液，使DNA溶解；3)细菌16S rRNA和真菌18S rRNA的PCR扩增：分别使用16S rRNA V3区和对大多数真菌18S rRNA基因5′末端具有特异性的带GC发夹的通用引物对总DNA模板进行PCR扩增；PCR扩增体系为：DNA 1μL 20ng，25μL r Taq PCR Mix；每种引物各0.5μL；双蒸水补足50μL；细菌16S rRNA PCR扩增条件为：94℃预变性5min，94℃45sec，65℃30sec，72℃1min，之后每一循环降0.5℃，20cycles；94℃45sec，55℃30sec，72℃1min，10cycles；72℃延伸10min；真菌18S rRNA PCR扩增条件为：94℃预变性5min，94℃30sec，47℃45sec，72℃1min，循环30次，72℃延伸10min；所述的细菌16S rRNA V3区通用引物为：SEQ ID NO 1；SEQ ID NO 3；对大多数真菌18S rRNA基因5′末端具有特异性的通用引物为：SEQ ID NO 4；SEQ ID NO 5；4)DGGE分离、染色、扫描和软件分析：将步骤3)得到的PCR产物通过DGGE进行分离，其中丙烯酰胺凝胶质量浓度为8％，细菌和真菌的变性梯度范围分别为40％‑60％、20％‑40％；电泳条件为电压130～150V，60℃下电泳300～240min；采用银染法对胶片进行染色，显色后，将DGGE胶片通过扫描得到电子图谱；应用Quantity one软件打开DGGE电子图谱，利用compare lanes功能，选择图谱上的各个泳道，自动生成条带的信号强度分布图，对条带进行相对定量分析；5)切胶回收条带DNA：用无菌小刀切割条带放入无菌离心管中，用50μL无菌去离子水清洗后，加入20μL TE溶液并于4℃静置过夜以释放条带中的DNA片段；对回收的DNA 进行PCR扩增，细菌引物为：SEQ ID NO 2；SEQ ID NO 3；真菌引物为：SEQ ID NO 4；SEQ ID NO 6；产物按照DNA回收纯化试剂盒进行纯化后连接T载体，转入大肠杆菌感受态细胞，通过蓝白斑筛选，挑选多个阳性克隆子进行菌落PCR扩增，细菌引物为：SEQ IDNO 1；SEQ ID NO 3；真菌引物为：SEQ ID NO 4；SEQ ID NO 5；6)将步骤5)得到的菌落PCR扩增产物与步骤3)的PCR产物按照步骤4)同时进行DGGE分离和染色，通过对比图谱上的条带，步骤5)的PCR产物电泳条带与目的条带处于同一位置的则为目的条带PCR产物；目的条带PCR产物进行PCR扩增，细菌引物为：SEQ IDNO 2；SEQ ID NO 3；真菌引物为：SEQ ID NO 4；SEQ ID NO 6；产物送测序，将所得序列与GenBank中已知序列进行比对，确定条带对应的微生物的属分类。