一种谷氨酸转运蛋白-3基因的cRNA 原位杂交探针及其制备方法

摘要

本发明公开了一种谷氨酸转运蛋白-3基因cRNA原位杂交的探针及其设计方法，按照如下步骤：(1)根据谷氨酸转运蛋白-3的Gene bank序列我们设计谷氨酸转运蛋白-3特异的引物，并且此对引物扩增出292bp的谷氨酸转运蛋白-3片段作为谷氨酸转运蛋白-3特异的探针序列；(2)构建谷氨酸转运蛋白-3的cRNA原位杂交的探针质粒；将探针质粒转化细菌后，细菌培养后进行测序；(3)制备谷氨酸转运蛋白-3的cRNA原位杂交探针；(4)检测谷氨酸转运蛋白-3的cRNA探针的原位杂交。

主权项

一种谷氨酸转运蛋白‑3基因cRNA原位杂交的探针，其特征在于，该探针的序列为：5'GCTGTGCGGAAGAAAAGAACCACGTGGACAAGAGGATCACAAGATTTGTGCTGCCCGTCGGCGCCACCATCAACATGGACGGCACTGCGCTCTATGAAGCCGTGGCAGCTGTGTTCATTGCGCAGCTGAACGGCATGGACCTGAGCATTGGGCAGATCATCACGATCAGCATCACAGCCACCGCTGCTAGCATTGGAGCTGCCGGTGTGCCCCAGGCTGGCCTGGTGACCATGGTGATCGTGTTGAGTGCCGTGGGGCTGCCTGCTGAGGACGTCACCCTCATCATTGCCGT3'；所述的谷氨酸转运蛋白‑3基因cRNA原位杂交的探针的制备方法如下：(1)根据谷氨酸转运蛋白‑3的Gene bank序列我们设计了谷氨酸转运蛋白‑3特异的引物，并且此对引物扩增出292bp的谷氨酸转运蛋白‑3片段作为谷氨酸转运蛋白‑3特异的探针序列，所述探针序列如上；其中，所述的谷氨酸转运蛋白‑3特异的引物是：上游引物是5'GCTGTGCGGAAGAAAAGAAC3'；下游引物是5'ACGGCAATGATGAGGGTGAC3'；(2)构建谷氨酸转运蛋白‑3的cRNA原位杂交的探针质粒，包括：(a)将大鼠的cDNA用谷氨酸转运蛋白‑3特异的引物进行PCR扩增；(b)将PCR产物用TIANGEN胶回收试剂盒进行胶回收；(c)将回收后的产物于4℃与多克隆位点两端具有T7，SP6启动子 的载体进行连接；(d)将连接好的探针质粒转化细菌后，细菌培养后进行测序；(3)制备谷氨酸转运蛋白‑3的cRNA原位杂交探针，包括：(a)经步骤(2)得到的细菌测序正确后，判断确认谷氨酸转运蛋白‑3探针序列插入载体的顺序是正向的；(b)使用BamHⅠ限制性内切酶对质粒进行酶切；(c)将酶切产物用TIANGEN胶回收试剂盒进行胶回收；(d)用SP6RNA聚合酶对探针进行体外转录标记；(4)检测谷氨酸转运蛋白‑3的cRNA探针的原位杂交，包括：(a)将大鼠用0.4%戊巴比妥钠深麻后，经左心室插管至升主动脉，用0.01mol/L的DEPC‑PBS的快速冲洗去除血液，再以4%多聚甲醛灌注固定；所述的0.01mol/L DEPC‑PBS是2.9克磷酸氢二钠，0.29克磷酸二氢钠，9.0克氯化钠用超纯水定容至1L后，再加入体积百分比为0.1%的DEPC1ml放置过夜后，高压灭菌制成的磷酸盐缓冲液；所述4%的多聚甲醛是40.0克多聚甲醛加入500.0ml蒸馏水加热使之解聚溶解后，再加入500.0ml的0.2mol/L PB缓冲液定容至1000ml；所述0.2mol/L PB缓冲液是用29.01克磷酸氢二钠，2.96克磷酸二氢钠加超纯水定容至500ml配制而成；(b)取材后进行脑组织的后固定：于4℃，用4%的多聚甲醛后固定24小时；(c)将固定好的组织进行切片：将组织切成25～30μm组织切片，并将切好的切片保存于0.01mol/L的DEPC‑PBS中，放于4℃冰箱备 用；(d)将切好的组织片用0.01mol/L的DEPC‑PBS清洗1次，室温，每次5‑10分钟；(e)将上述清洗过的片子用5x SSC清洗2次，室温，每次5‑10分钟；所述5x SSC是由20x SSC用超纯水稀释的，20x SSC为一种柠檬酸缓冲液；(f)将5x SSC清洗后的组织片浸入预杂交液中，于55℃，在杂交炉孵育1‑2小时；所述预杂交液是由5ml的去离子甲酰胺，2.5ml的20x SSC溶液，200μl的50x Denhardt’s溶液，50μl的浓度为200mg/ml的Heparin溶液，100μl的浓度为10mg/ml的tRNA溶液，100μl的浓度为1g/ml的CHAPS溶液，100μl的浓度为10%的Tween‑20溶液，100μl的浓度为0.5mol/L的pH8.0的EDTA溶液和1.85ml的DEPC‑H2O混合配制而成；所述50x Denhardt’s为一种常用的杂交试剂；所述200mg/ml的Heparin为200mg的Heparin粉末溶于1ml的DEPC‑H2O中配制而成；所述10mg/ml的tRNA为10mg的tRNA粉末溶于1ml的DEPC‑H2O中配制而成；所述1g/ml的CHAPS为1g的CHAPS溶于1ml的DEPC‑H2O中配制而成；所述10%的Tween‑20为100μl的Tween‑20溶于900μl的DEPC‑H2O中配制而成；所述0.5mol/L的pH8.0的EDTA为186.1g二水乙二胺四乙酸二钠加入800ml的DEPC‑H2O中在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH调pH值至8.0然后定容至1L配制而成高压灭菌备用；所述DEPC‑H2O为1L超纯水加入体积百分比为0.1%的DEPC1ml，放置过夜并高压灭菌处理后的水；(g)将预杂交孵育后的组织切片浸入杂交液中，于55℃，在杂交炉中孵育16‑20小时；所述杂交液是上述预杂交液中加入终浓度为1.0μg/ml的谷氨酸转运蛋白‑3基因cRNA原位杂交的探针配置成的；(h)杂交后用1x SSC洗涤杂交的组织切片，37℃，2次，每次10分钟；(i)用2x SSC洗涤上述的组织切片，37℃，2次，每次10‑15分钟；(j)用10μg/ml的RNase A处理，37℃，1次，每次30‑40分钟；(k)用2x SSC洗涤上述的组织切片，室温，1次，每次10分钟；(l)用0.01mol/L PBS洗涤上述的组织切片，室温，1次，每次10分钟；所述0.01mol/L PBS是2.9克磷酸氢二钠，0.29克磷酸二氢钠，9.0克氯化钠用超纯水定容至1L配置的磷酸缓冲液；(m)按1:2000的抗体效价，在PBS溶液中加入Anti‑Digoxigenin–AP抗体，对洗涤后的组织切片进行孵育，室温，放置过夜；(n)将经过上步抗体孵育的组织片用0.01mol/L PBS洗涤，于室温，清洗3次，每次10‑15分钟；(o)用TS9.5洗涤上述PBS洗涤后的组织片，室温，清洗2次，每次15‑20分钟；所述TS9.5为是由终浓度为摩尔浓度为0.1mol/L Tris‑HCl（PH9.5）,摩尔浓度为0.1mol/L NaCl溶液和摩尔浓度为50mmol/LMgCL2用超纯水配制而成；(p)将上述切片放于NBT‑BCIP反应液中避光孵育4～6小时，在此过程中观察切片呈色强度；所述NBT‑BCIP是一种Roche公司生产的呈色反应液；(q)当呈色完成后，将切片用PBS清洗3次，室温，每次10‑15分钟；(r)将上述洗涤后切片表于载玻片上；(s)晾干切片，再经过二甲苯脱色，封片后观察。