一种高通量检测蛋白相互作用的方法及其应用

摘要

本发明公开了一种高通量检测活细胞内蛋白相互作用的方法，以逆转录病毒为基础的BiFC系统，分别将“诱饵”蛋白cDNA克隆入含YFPn的逆转录病毒表达载体，而将18000个人类基因cDNA分别克隆入含YFPc的逆转录病毒表达载体，通过逆转录病毒感染，产生同时稳定表达待筛选基因-YFPc融合蛋白和“诱饵”蛋白-YFPn融合蛋白的细胞，如果“诱饵”蛋白能与目标蛋白相互作用，通过流式细胞仪在FITC波长将观察到发荧光的细胞并能检测信号强弱。本发明用于筛选在刺激或非刺激条件下与目的蛋白相互作用的蛋白网络，可检测较弱或瞬时相互作用，信噪比高，假阳性率低，灵敏度高。

主权项

一种高通量检测活细胞内蛋白相互作用的方法，其特征在于其是顺次按照以下步骤进行：A）BiFC质粒库的构建：将哺乳动物基因的 cDNA克隆入含YFPc 的逆转录病毒表达载体pB‑CMV‑NC/CC‑puro中，获得含YFPc的质粒；B）YFPn‑诱饵蛋白稳定表达细胞系构建：将待研究蛋白的cDNA亚克隆融合到逆转录病毒表达载体pB‑CMV‑CVN/VN‑neo中，通过转化、挑取单克隆、质粒提取，获得该诱饵蛋白与YFPn的融合蛋白真核表达载体，经过病毒包装后，使用YFPn载体上的抗生素抗性筛选，获取带有YFPn的诱饵蛋白稳定表达细胞系；C）YFPc‑X逆转录病毒包装:将步骤A）获得的带有YFPc的质粒分为若干个库，每个库含等量的不同质粒，然后将这些质粒库进行YFPc‑X逆转录病毒的包装，获得对应的病毒库；D）YFPn‑诱饵蛋白与YFPc‑X共表达的稳定细胞系构建：将上述病毒库分别感染带有YFPn的诱饵蛋白稳定表达细胞，感染后筛选出YFPn‑诱饵蛋白与YFPc‑X共表达的细胞群；E）BiFC 筛选：对YFPn‑诱饵蛋白与YFPc‑X共表达的细胞群进非诱导条件下的相互作用筛选或诱导条件下的相互作用筛选，收集BiFC阳性细胞，进行扩大培养；F）细胞总mRNA的提取：筛选后获得的BiFC阳性细胞进行扩大培养后，进行细胞mRNA的提取，获得mRNA；G）PCR扩增：利用pB‑CMV‑NC ‑puro载体设计引物SEQ ID NO:1和引物SEQ ID NO:2，根据pB‑CMV‑CC‑puro 设计引物SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4，以上述mRNA为模板反转录为cDNA后，进行cDNA的RT‑PCR扩增，PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳鉴定之后对PCR产物进行纯化；H）高通量测序：将纯化后的PCR产物进行高通量测序分析出所有的cDNA来至哪些基因，即可知与诱饵蛋白相互作用的蛋白质网络。