毛葡萄离体再生培养方法

摘要

本发明公开了一种毛葡萄离体再生培养方法，包括以下步骤：无菌系的建立、不定芽诱导、生根培养及炼苗移栽。本发明采用植物组织培养技术成功实现毛葡萄叶片离体再生，毛葡萄再生率可达37%以上，最高可达93.3%，生根率可达90%以上，成活率可达100%，为毛葡萄遗传转化奠定坚实基础，为葡萄其他优良性状向毛葡萄的转移提供了一条有效的途径。本发明方法简单，成本低廉，使用效果好。

主权项

一种毛葡萄离体再生培养方法，其特征在于：包括以下步骤，步骤一、无菌系的建立：在生长季节选取生长健壮的毛葡萄新梢作为外植体，用自来水冲洗干净，在超净工作台上，先用体积百分比为70%的酒精漂洗30s，再用无菌水冲洗3次后，用质量百分比为0.1%的升汞溶液浸泡消毒8‑10min后，用无菌水冲洗5‑6次，然后剪除新梢两端褐化部分后，剪成单芽茎段，接种到培养基中，在温度为25±1℃，光照强度为40umol·s‑1·m‑2，光照时间为12h/d的培养条件下，培养诱导至腋芽萌发，获得诱导的腋芽叶片；步骤一中采用的培养基为MS培养基中添加了2.0mg/L 的6‑苄基嘌呤，0.2mg/L的吲哚乙酸，20g/L蔗糖和5g/L琼脂粉，其pH值为5.8‑6.0；步骤二、不定芽诱导：取步骤一中获得的诱导的腋芽叶片剪成0.5×0.5cm2见方的小块，在叶片背面沿叶脉垂直方向划三刀，正面向上接种到培养基上，在温度为25±1℃，光照强度为40umol·s‑1·m‑2，光照时间为12h/d的条件下培养20d，叶片开始向上卷起，25‑30d划伤处再生出不定芽，30‑45d大量产生再生不定芽；步骤二中采用的培养基为MS培养基中添加8.0‑8.5 mg/L 的6‑苄基嘌呤，0.3‑0.35 mg/L的吲哚丁酸，0.20‑0.26 mg/L的吲哚乙酸，18‑32 g/L蔗糖和5g/L琼脂粉，pH5.8‑6.0；步骤三、生根培养：取步骤二中产生的不定芽，将其接种到1/2MS生根培养基中，先光下培养7d，再暗培养7d后，然后转入光下继续培养至正常生根，获得试管苗；培养温度为25±1℃，光照强度为40umol·s‑1·m‑2，光照时间为12h/d；步骤三中采用的1/2MS生根培养基是指MS培养基中的大量元素减半，其它元素不变，并添加8.0‑8.5 mg/L的6‑苄基嘌呤，0.3‑0.35 mg/L吲哚丁酸，0.20‑0.26 mg/L吲哚乙酸，18‑32g/L蔗糖和5g/L琼脂粉，pH5.8‑6.0；步骤四、炼苗移栽：选取步骤三中生有3‑4条根，长为4‑5cm的试管苗，在102.8umol·s‑1·m‑2的光照条件下炼苗7d，然后从培养瓶中取出试管苗，洗净试管苗根部培养基，用质量百分比为0.1%KMnO4溶液浸根10s，再移栽到灭菌的珍珠岩基质中，用1/8MS营养液浇透，之后每隔7d浇灌1次营养液，并从移栽后第2‑3d始每隔7d浇灌1次1000倍质量百分比为40%的多菌灵溶液，加盖与营养钵相同大小的塑料杯保持湿度，置于温度为25±1℃的培养室内培养至植株长出3‑5条新根后移栽到盛有营养土的营养钵中，置于温室内炼苗30d，最后定植到大田即可；步骤四中采用的1/8MS营养液是指MS培养基中的大量元素为1/8，其它元素不变，并添加0.05mg/L吲哚乙酸。