采用芥菜型油菜基因BAN和DFR共转化提高大肠杆菌中原花色素含量的方法

摘要

本发明公开了一种采用芥菜型油菜基因BAN和DFR共转化提高大肠杆菌中原花色素含量的方法。本发明从芥菜型油菜紫叶芥种皮的cDNA中克隆花色素还原酶BAN基因和4-二氢黄酮醇还原酶DFR基因，构建含BAN和DFR基因的原核表达载体pET-BAN-DFR，将BAN和DFR基因同时导入DH5α大肠杆菌。转化菌株在LB液体培养基中，25-37℃，150-250rpm(转/分钟)培养6-14小时候后，再在含黑色大豆种皮提取物(0.5-1.0g/L)的LB液体培养基中，25-37℃，150-250rpm震荡培养36-54小时后，离心收集菌体，采用DMACA-HCl法测定大肠杆菌所含的原花色素的量。本发明获得的转基因大肠杆菌中原花色素的含量显著提高，最高达到非转化对照菌株的19.8倍。

主权项

一种采用芥菜型油菜基因BAN 和DFR 共转化提高大肠杆菌中原花色素含量的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）从芥菜型油菜种皮的cDNA中克隆花色素还原酶BAN基因和4‑二氢黄酮醇还原酶DFR基因；（2）把BAN 基因和DFR 基因可操作性地连接于表达调控序列，形成含BAN 基因和DFR基因的原核表达载体pET‑BAN‑DFR；（3）将BAN和DFR基因同时导入DH5α大肠杆菌，转化菌在LB液体培养基中，25‑37℃，150‑250rpm(转/分钟)培养6‑14小时后，再在含黑色大豆种皮提取物的 LB液体培养基中，25‑37℃，150‑250rpm震荡培养36‑54小时后，在室温下，离心力为10000‑12000g离心收集菌体；（4）采用DMACA‑HCl法测定大肠杆菌所含的原花色素的量，筛选获得原花色素含量提高基因大肠杆菌菌株；步骤（3）中，所述的LB液体培养基中含有0.5‑1.0g/L黑色大豆种皮提取物；所述的黑色大豆种皮提取物的提取方法：将黑色大豆种皮用粉碎机粉碎，过1.0 mm 的筛，将用30％‑70％(v/v)的乙醇作为萃取溶剂，大豆种皮量与溶剂用量之比为1∶4‑8(w/w)，萃取温度为60℃‑70℃，萃取时间为4‑8小时；回收乙醇后的浓缩液在8000‑10000g的离心机中离心10‑15min，过滤去杂，然后在浓缩液中加入丙酮，浓缩液与丙酮之比为1∶1‑3(v/v)，搅拌混匀2‑5min，过滤除去杂质，浓缩液经回收丙酮后，在40℃‑60℃下真空干燥即得大豆种皮提取物。