一种利用免疫组织化学鉴定冬虫夏草无性型的方法

摘要

本发明涉及一种免疫组织化学鉴定冬虫夏草无性型的方法，包括以下步骤：菌丝体抗体的制备、染色、比较染色结果三个步骤；从染色图片就可直接看出，阳性染色(被染上颜色)即为冬虫夏草，若阴性染色(不被染上染色)就不是冬虫夏草无性型。本发明创造性地采用与冬虫夏草同源性最高的北虫草的菌丝对多价血清进行吸附，具有特异性强特点，而且该鉴定方法不需仪器，简单方便，易推广；染色时间短，比传统鉴定方法和分子生物学方法更快速费用更低，可用于冬虫夏草菌丝的无性型鉴定工作。

主权项

一种免疫组织化学鉴定冬虫夏草无性型的方法，其特征在于所述鉴定是用免疫组织化学技术对菌丝进行鉴定；所述鉴定包括以下步骤：菌丝体抗体的制备、染色、比较染色结果；1).菌丝体抗体的制备：a).取新鲜的冬虫夏草的菌丝体，用蒸馏水冲洗，干燥，研磨，称重研磨后的菌丝30～60mg，接着将20～30mlPBS磷酸盐缓冲溶液与10～20ml青霉素和链霉素的混合溶液混合，最后用30～50ml含青霉素、链霉素、及PBS磷酸盐缓冲溶液的混合溶液稀释所称取的菌丝，作为菌丝体抗原，冰冻保存备用；b).取健康兔2～4只，观察7～10天，无异常反应后，用步骤a)得到的菌丝体抗原分别对其腹部进行多点注射菌丝体抗原，每只注射3～7ml，7～10天后进行2～5次免疫，共强化免疫3～6次；c).根据步骤b).所述方法得到的最后免疫10～20天后的健康兔，分别对其耳静脉部位采血，检测抗体效价，在琼脂扩散出现明显白色沉淀线者，取与之对应的兔子，对其心脏部位采血分离血清，把北冬虫夏草的菌丝粉加入分离的血清中，于3～5℃静置1.5～3h，使其吸附与北冬虫夏草结合的抗体；d).根据步骤c).所述方法对吸附与北冬虫夏草结合的抗体后的血清，对其进行离心；将离心后的血清，静置10～25min后，吸取其上清液，分装、冷冻保存备用；2).染色：e).准备待使用的载玻片3张，然后用PBS磷酸盐缓冲溶液清洗研磨后的菌丝，接着将清洗后的冬虫夏草菌丝分别涂在三张载玻片上，并分别标记为：菌丝体涂片A、B、C；f).将e)步骤中的菌丝体涂片A、B、C放在湿盒内，用0.3％过氧化氢溶液封闭内源性过氧化氢酶，接着于室温条件下静置25～40min，静置后用PBS磷酸盐缓冲溶液冲洗3～5次，每次3～7分钟；g).根据步骤f)所述方法封闭内源性过氧化氢酶后，在菌丝体涂片A上加入正常10％马血清1～3滴，于室温条件下静置25～40min后，防止非特异性蛋白结合，用PBS磷酸盐缓冲溶液冲洗3～5次，每次3～7分钟；接着加入稀释40倍后的根据步骤d)得到的抗菌丝体血清上清液1～3滴，于32～40℃静置50～70min，再用PBS磷酸盐缓冲溶液冲洗3～5次，每次3～7分钟；最后加入稀释40倍后的羊抗兔HRP标记血清1～3滴，于35～40℃静置40～55min后，用PBS磷酸盐缓冲溶液冲洗3～5次，每次3～7分钟；在菌丝体涂片B、C上同样按上述步骤分别叠加上述三种血清；h).根据步骤g)所述的方法，再在菌丝体涂片A、B、C上分别加入3，3‑二氨基联苯胺溶液染色，显色1～5min或在显微镜下控制进行；i).根据步骤h)所述的方法，显色后用甘油作封剂封片，于显微镜下观察；3).比较染色结果；j).对照用PBS磷酸盐缓冲溶液代替抗菌丝体血清。