一种构建蔷薇属植物染色体物理图谱的方法

摘要

本发明是一种构建蔷薇属植物染色体物理图谱的方法。以改良的酶解去壁低渗法制备有丝分裂中期染色体制片；探针标记采用缺口平移法，用经地高辛修饰的核苷酸标记携带目的基因的质粒DNA，使之成为杂交探针。然后用DNA探针直接与染色体变性后的DNA单链杂交，再用偶联有罗丹明的抗地高辛抗体与探针上标记的地高辛进行特异性免疫反应，检测目的基因在染色体上的位置和分布得到染色体物理图谱。本发明的优点：针对染色体为小型染色体且细胞内含物较多的蔷薇属植物荧光原位杂交，能够稳定地获得清晰的染色体物理图谱，对蔷薇属的植物具有普遍适用、易操作。

主权项

一种构建蔷薇属植物染色体物理图谱的方法，其特征在于按以下步骤进行：1）染色体制备（1）材料的采集、预处理与保存：选取刚萌发且无病虫害的月月粉营养芽，采集其茎尖2‑3cm，用镊子剥去茎尖外部的幼叶，切取茎尖1‑2cm，将茎尖放于1：1配置的0.002mol/l的8‑羟基喹啉和0.02％的秋水仙素的预处理液中3‑4小时，将茎尖从预处理液中取出后，用无菌水冲洗3次，然后放于0.075mol/l的氯化钾溶液中30分钟，把茎尖从氯化钾溶液中取出后，用无菌水冲洗3次，然后放于由无水乙醇：冰乙酸＝3v：1v配制的卡诺固定液中，固定过夜，将茎尖从固定液中取出，用无菌水冲洗3次，然后放于70％的乙醇溶液中，置于4℃冰箱中，保存备用；（2）染色体制片：将月月粉的茎尖从保存液中取出，用无菌水冲洗3次后，在体式解剖镜下，无菌环境条件中分离出茎尖生长点，切取1‑2mm放于0.25‑0.1mol/l盐酸溶液中10‑15分钟，将酸解后的茎尖生长点用无菌水冲洗干净，放于2％‑5％纤维素酶和1％‑3％果胶酶的混合液中酶解，于37℃酶解3‑4小时，把酶解完全的茎尖生长点用无菌水轻轻冲洗2次，放于37℃的无菌水中，低渗90分钟；将低渗液去除，加入由无水乙醇：冰乙酸＝3v：1v配制的卡诺固定液中，涡旋混匀，使之成为原生质体悬液，将悬液3000rpm离心，去除上清液，再次加入卡诺固定液重悬，涡旋混匀，吸取悬液，滴于事先清洗并冰冻的防脱载玻片上，将悬液均匀吹开，并迅速置于酒精灯外焰烘烤2‑3秒，然后空气干燥，制备好的制片于普通光学显微镜下，用40×物镜观察，选取有较多分裂中期相且染色体分散较好的制片，放于玻片盒中，并置于‑20℃冰箱中，保存；2）探针标记（1）探针纯度和浓度检测：用双蒸水去除背景，然后把连接有45SrDNA片段的质粒稀释后，分别测出波长为260nm和280nm时的吸光值A260和A280，根据双链DNA计算方法，算出质粒双链DNA的纯度和浓度，选取纯度大于1.8，浓度大于62.5μg/ml的质粒进行以下实验；（2）探针标记：采用缺口平移法，用地高辛标记该质粒，即每个反应体系含1μg质粒DNA和地高辛标记试剂，于15℃下反应90分钟，终止反应后，于‑20℃保存备用；3）染色体荧光原位杂交将步骤1）保存的月月粉染色体制片于60℃烘干1‑2小时，滴加10μg/ml胃蛋白酶溶液于制片上表面，放于37℃恒温培养箱中20‑40分钟；用2×SSC漂洗5分钟，用体积百分含量75％‑95％‑100％乙醇依次脱水3次各5分钟，空气干燥；于70℃‑80℃下在体积百分含量70％甲酰胺中变性后，立即在体积百分含量75％‑95％‑100％冷乙醇依次脱水3次各5分钟，空气干燥，配置含体积百分含量50％甲酰胺、10％硫酸葡聚糖、23% 2×SSC、3%鲑鱼精DNA、14%地高辛标记探针的杂交液，将杂交液于80℃‑90℃变性后，迅速放于冰水中10‑20分钟，将杂交混合液均匀地滴加到染色体制片上，于37℃杂交过夜；                              4）信号检测在37℃下用2×SSC洗脱2次，每次5分钟，然后在室温下分别用2×SSC、1×PBS各洗脱1次，每次5分钟，滴干载玻片，信号检测采用结合罗丹明的抗地高辛抗体试剂盒，与抗体结合完成后，用1×PBS洗脱3次，每次5分钟，滴干载玻片，用DAPI浸染5分钟，再次用1×PBS洗脱3次，每次5分钟，滴干载玻片，在载玻片上滴加抗荧光淬灭封片剂，挤出多余液体，封片，空气干燥，在激光共聚焦显微镜下先用普通光源找到染色体，再用激光扫描，去除背景后拍照得到染色体物理图谱。