糖类抗原15-3(CA15-3)定量测定试剂盒及其检测方法

摘要

本发明公开了一种糖类抗原15-3(CA15-3)的定量测定试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含CA15-3磁分离试剂，酶反应物，反应增强剂，稀释液，CA15-3标准品、CA15-3质控品，清洗液浓缩液以及底物溶液。本发明还公开了该试剂盒的制备方法。本发明试剂盒将化学发光技术与免疫磁微粒相结合，提供了一种接近均相的反应体系，与现有技术相比，本发明试剂盒具有更高的检测灵敏度和特异性，同时在出结果时间上相对现有技术缩短了至少10分钟，并达到了较佳的性能参数，并且大大降低了产品成本。

主权项

一种糖类抗原CA15‑3的定量测定试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含CA15‑3磁分离试剂，酶反应物，反应增强剂，稀释液，CA15‑3标准品、CA15‑3质控品，清洗液浓缩液以及底物溶液；所述试剂盒中各组分按照如下制备方法制得：一、磁分离试剂的制备过程一)、磁珠缓冲液配制操作步骤，配制1L：1、称取Tris 4.58g和NaCl6.81g于1L容器中，称取0.96g Tween‑20于20mL容器中加适量水使其完全溶解后，倒入上述1L容器中；2、用移液器将Proclin‑300量取0.2mL于10mL纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中，然后在上述1L容器中加入800mL纯化水，充分搅拌；3、调节pH，控制pH在7.95‑8.05之间；4、称取BSA 3g倒入上述1L容器中；5、最后定容至1000mL，用0.2µm滤器过滤即得；二)、磁分离试剂的制备过程1、将1.0mg辛二酸二琥珀酰亚胺酯溶于50µl DMSO中，取2mg抗CA15‑3单克隆抗体溶于pH9.5的0.1mol/L  PB缓冲液中至总体积为1mL；2、用移液枪吸取上述辛二酸二琥珀酰亚胺酯加入到步骤1的抗体溶液中，置室温90min；3、将步骤2抗体溶液加入到浓缩管中，然后放入到高速冷冻离心机中在3000g下离心30min浓缩至0.5mL；4、取0.5mL磁珠，加入5mL反应杯中，经磁铁吸附2分钟后吸取上清，然后加入1.5mL  pH9.5  0.1mol/L  PB，混匀30秒，然后加入步骤3获得的抗体溶液，混匀后室温反应4小时；5、加入0.3mL 1mol/L的TRIS溶液37℃15分钟，然后加入1.5mL  pH 7.2 0.1mol/L  PB清洗 已经标记的磁珠，混匀30秒；6、用100mL磁珠保存液将磁珠转入玻璃瓶；7、将步骤6获得的溶液与上述磁珠缓冲液按照1∶1的体积比例混匀，即得磁分离试剂；二、酶反应物的制备过程一)、酶反应物稀释液配制操作步骤，配制1L：1、取Tris 6.06g、NaCl 13.0g、Zncl20.05g、Proclin‑3000.2mL和MgCl20.05g于烧瓶中，然后在烧瓶中加入800mL纯化水，充分搅拌，使试剂完全溶解；2、调pH，控制pH在7.35‑7.45范围内；3、称取BSA 3g倒入上述烧杯中；4、最后定容至1000mL，用0.2um滤器过滤即得；二)、碱性磷酸酶ALP与抗CA15‑3单克隆抗体的偶联1、取10mg ALP加入5mL生理盐水中，加入到浓缩管中，3000rpm离心20分钟，浓缩至1毫升；2、向步骤1获得浓缩液中加入0.2mL的0.1M NaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟，然后装入透析袋中，用1mM pH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜，收集保留液；3、向步骤2获得保留液中加入0.2M pH9.5碳酸盐缓冲液，使pH升高到9.0，然后立即加入2.5mg抗CA15‑3单克隆抗体，搅拌2小时，再加入0.1mL的4mg/mL NaBH4溶液，混匀，置4℃下2小时；4、将上述溶液装入透析袋中，用0.15M pH7.4 PBS透析，4℃过夜，收集保留液；5、向步骤4获得保留液中逐滴加入等体积饱和硫酸铵，置4℃ 1小时，然后3000rpm离心半小时，弃上清，沉淀物用半饱和硫酸铵洗二次，最后沉淀物溶于20mL的0.15M pH7.4的PBS中；6、将步骤5获得的溶液装入透析袋中，用0.15M pH7.4的PB缓冲液透析5个小时去除铵离子，收集保留液后10,000rpm离心30分钟去除沉淀，收集上清液，按照体积比为1∶100的比例添加1M MgCl2溶液，即得碱性磷酸酶ALP与抗CA15‑3单克隆抗体的偶联物；将收集到的碱性磷酸酶ALP与抗CA15‑3单克隆抗体的偶联物用上述步骤一)获得的酶反应物稀释液以1∶1000的体积比混合均匀，即得酶反应物；三、反应增强剂的制备过程，配制1L：1、取Tris 1.56g和NaCl 4.23g于1L容器中，取0.2mL Proclin‑300于10mL纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中； 2、取800mL纯化水于上述1L容器中，充分搅拌直至完全溶解，调pH在7.35‑7.45之间；3、称取Mak33  0.9g于上述1L容器中；最后定容1000mL，完全溶解后，用0.2µm滤器过滤即得；四、稀释液的制备过程，配制1L：1、称取NaCl 9.0g和BSA 60g于1L的容器中；2、取0.5mL Proclin‑300加10mL纯化水溶解，倒入上述1L的容器中；3、最后定容1000mL，完全溶解后，用0.2um滤器过滤即得；五、CA15‑3校准品和CA15‑3质控品的配制：CA15‑3校准品中CA15‑3抗原的浓度分别为0.1，0.3，1，2.5，7.5U/mL ；CA15‑3质控品中CA15‑3抗原的浓度分别为0.3、2.5U/mL；六、清洗液浓缩液的制备过程，配制1L：1、取Tris 12.54g和NaCl 325.6g于1L容器中；2、取5g Tween‑20于100mL容器中加20mL水使其完全溶解后，倒入上述1L容器中；3、取0.2mL Proclin‑300于盛有10mL纯化水的烧杯中完全溶解后，倒入上述1L容器中；4、取800mL纯化水于上述1L容器中，充分搅拌，直至完全溶解；5、调pH，控制其范围在7.35‑7.45之间；6、最后定容1000mL，完全溶解后用0.2µm滤器过滤即得；七、底物溶液的制备过程，配制1L：1、取Tris 2.35g、NaCl6.41g、Na2SO30.002g和Proclin‑3000.2mL于1L烧杯中；2、取600mL纯化水于1L烧杯中，充分搅拌直至完全溶解，调pH在7.95‑8.05之间；3、加入250mL Lumi‑Phos 480，用0.2µm滤器过滤收集滤液，用纯化水定容至1000mL，混匀后即得。