酵母展示脂肪酶催化合成十二烯基琥珀酸淀粉酯的方法

摘要

本发明公开了一种酵母表面展示脂肪酶催化合成十二烯基琥珀酸淀粉酯的方法，包括：将谷物淀粉溶于水，吸涨后加入十二烯基琥珀酸酐乙醇溶液和酵母表面展示脂肪酶，在55～65℃下搅拌反应1～1.5小时，分离、纯化制得十二烯基琥珀酸淀粉酯。所述的酵母表面展示脂肪酶制备方法为：将线性化处理的重组质粒转入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115，将所得转化子接种于BMMY培养基中，诱导培养72～144小时后离心收集菌体，菌体经冲洗、生物印迹和冷冻干燥制得酵母表面展示脂肪酶。本发明通过将脂肪酶展现在细胞外，利用该酶制剂催化合成十二烯基琥珀酸淀粉酯，不仅提高了转化效率，而且缩短了反应时间，降低了生产成本。

主权项

一种酵母表面展示脂肪酶催化合成十二烯基琥珀酸淀粉酯的方法，包括： 人工合成米根霉（Rhizopus oryzae）的脂肪酶基因和毕赤酵母GS115的细胞壁α凝集素基因，同时在脂肪酶基因C端加上编码连接肽GSSGGSGGSGGSGGSGS的基因片段，连接得到核苷酸序列pro‑ROL‑linker‑α‑agglutinin；pro‑ROL为脂肪酶基因，Genbank号为AF229435，α‑agglutinin为细胞壁α凝集素基因，Genbank号为M28164，linker为编码连接肽GSSGGSGGSGGSGGSGS的基因片段； 以上述人工合成序列为模板，利用以下引物对，进行PCR扩增， 上游引物：5’‑AAGGAAAAAAGAATTCGTTCCAGTTTCTGG‑3’； 下游引物：5’‑TTTTCCTTTTGCGGCCGCTAATGAAACG‑3’ 用EocR I和Not I同时酶切PCR产物和pPIC9K质粒，并在T4连接酶的作用下过夜连接形成pPIC9K‑ROL质粒，通过电泳检验并回收质粒； 用Sal I对pPIC9K‑ROL质粒进行酶切线性化处理，然后将15μl线性化质粒加入到毕赤酵母GS115感受态细胞中，转入电转杯中，冰浴15min，然后在1500V，400Ω，25μF条件下电击10ms，并加入1ml预冷的山梨醇； 将电转产物400μl涂于MD平板上，筛选阳性转化子，然后将阳性转化子涂于不同浓度的G418平板上，根据阳性转化子对G418的抗性筛选出Mut表型的多拷贝阳性重组菌株； 将多拷贝阳性重组菌株接种在BMGY培养基中发酵培养30h，离心收集细胞；再将细胞置于含有体积百分比0.5%甲醇的BMMY培养基中诱导培养144h，离心收集细胞，用水冲洗后，接种至YGC培养基中30℃培养120h，然后3000g离心分钟收集菌体，蒸馏水洗涤后再用50mM pH7.0磷酸缓冲液洗涤，然后与2倍体积油酸混合，‑80℃下预冻后再经德国Christ真空冷冻干燥机干燥24h，用己烷洗涤除去油酸，再进行再真空干燥去除己烷，即得到经生物印迹处理的酵母表面展示脂肪酶； 取350g谷物淀粉用水配制成35%淀粉乳、于65℃下吸水处理15min使淀粉乳吸水膨胀，冷却后加入1g上述制备的酵母表面展示脂肪酶，然 后分批加入10ml体积浓度为15%的十二烯基琥珀酸酐乙醇溶液，置于85‑1型磁力搅拌器中搅拌开始反应，转速为200转/分钟，反应温度保持在60℃，反应1h后停止搅拌，调节pH值至7.0，经过脱水、醇洗、干燥、粉碎、筛分即得到产品。