胎盘来源的间充质干细胞表面差异膜蛋白的检测方法

摘要

本发明涉及干细胞差异膜蛋白的检测方法，旨在提供一种胎盘来源的间充质干细胞表面差异膜蛋白的检测方法。该方法包括：间充质干细胞的分离和培养、间充质干细胞膜蛋白的提取、双向荧光差异凝胶电泳法获取膜蛋白凝胶图谱、质谱分析及验证。本发明首次将2D-DIGE用来对干细胞膜表面特殊差异表面标志的检测，可以在同一块凝胶上对不同样品中蛋白质进行定量比较分析，在每块凝胶中加入了内标，DIA和BVA软件可以自动地根据每个蛋白质点的内标对其表达量进行校准，最大程度上降低了不同批次胶与胶之间的误差，反应了蛋白质的真实改变程度，降低了假阳性率及假阴性率。

主权项

胎盘来源的间充质干细胞表面差异膜蛋白的检测方法，其特征在于，包括以下步骤： （1）间充质干细胞的分离和培养 取新鲜胎盘组织剪碎，胶原酶消化，收集消化得到的细胞悬液，使用Ficoll‑PaqueTM PLUS人淋巴细胞分离液进行密度梯度离心，收集白膜层，洗两遍，收集细胞，常规培养；具体步骤是： 无菌条件下将胎盘用预热的PBS充分洗涤去血渍后，剪碎，剪成尽可能小的组织块，置于0.1%四型胶原酶中消化，37℃消化，30min，过滤，用PBS冲洗，收集消化液和冲洗液，1200rpm离心10min，收集细胞沉淀，用5mlPBS重悬，加至5ml相对密度为1.077g/L的含有Ficoll‑PaqueTM PLUS人淋巴细胞分离液上，进行梯度离心，离心条件为20℃、2000rpm、25min；离心后，吸取管中白膜层，PBS洗涤两次，收集细胞；间充质干细胞专用培养基重悬，接种于6孔培养板中，置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中，行常规培养及传代； 取新鲜脐带组织，剥离血管，剪碎，胶原酶消化，收集消化得到的细胞悬液，离心，收集细胞，常规培养；具体步骤是： 无菌条件下将脐带用预热的PBS充分洗涤去血渍后，剥离脐动静脉血管，剪成1cm3见方的小块，置于0.1%四型胶原酶中消化，37℃消化，1h，过滤，用PBS冲洗，收集消化液和冲洗液，1200rpm，离心10min，弃上清，PBS洗涤细胞沉淀；间充质干细胞专用培养基重悬，接种于6孔培养板中，置于37℃、5%CO2饱和湿度培养箱中，行常规培养及传代； 所有间充质干细胞均培养至对数生长期，用于移植； （2）间充质干细胞膜蛋白的提取 反复冻融法使得细胞破碎，然后通过梯度离心得到含有膜蛋白的组分； （3）双向荧光差异凝胶电泳法获取膜蛋白凝胶图谱 通过双向荧光差异凝胶电泳法，得到Cy2、Cy3及Cy5荧光素标记的不同种类的膜蛋白凝胶图谱，采用DeCyder2D图像分析软件进行分析，识别组间差异表达的蛋白质点；具体包括以下步骤： ①内标样品制备：N1、N2两个样品各取50μg，体积10μl，加入到同一个eppendorf管里，震荡混匀，离心；然后50μg每管分装成2管； ②储存液的制备：把荧光素从‑20℃的冰箱中取出，轻旋，室温静置5min，吸5μlDMF至染料管中，震荡离心，配制成lnmol/μl储存液； ③工作液的制备：首先取1.8μl DMF到eppendorf管，然后吸取1.2μl储存液到一个eppendorf管中，震荡离心即配成400pmol/μl的工作液；避光保存； ④样品标记：将每1μl工作液和50μg蛋白的比例进行荧光标记；整个操作中避光进行；冰上避光放置30min，每管蛋白中加入lμl赖氨酸终止标记反应； ⑤样品准备：将分别用Cy2、Cy3和Cy5标记的样品加入到同一eppendorf管中，震荡混匀，短暂离心；避光操作；每块胶上加入等体积的2×上样缓冲液冰上静止10min，准备上样，缓冲液：7mol/L尿素、2mmol/L硫脲、4%CHAPS及65mmol/L DTT； 标记成分描述如下： 拟加入胶1中的样品：用Cy2标记的样品，含胎盘来源干细胞膜蛋白和脐带来源干细胞膜蛋白各25μg；用Cy3标记的样品，含胎盘来源干细胞膜蛋白50μg；用Cy5标记的样品，含脐带来源干细胞膜蛋白50μg； 拟加入胶2中的样品：用Cy2标记的样品，含脐带来源干细胞膜蛋白和胎盘来源干细胞膜蛋白各25μg；用Cy3标记的样品，含脐带来源干细胞膜蛋白50μg；用Cy5标记的样品，含胎盘来源干细胞膜蛋白50μg； ⑥等电聚焦 分别将拟加入胶1、胶2中的Cy2、Cy3、Cy5三种荧光标记样品混合在一起；加入适量水化液和pH4‑7的0.5%v/v IPG buffer振荡混匀使各胶上样的总体积为450μl，将蛋白溶液吸至IPG胶条槽内，将pH4‑7NL、24cm的IPG干胶条放入含蛋白的胶条槽中，覆盖一层Immobiline Drystrip覆盖液2ml，置于IPGphor等电聚焦仪上，设置程序，使水化和聚焦均在20℃下进行，其中于30V低电压水化12h，然后经过100V0.5h、500V0.5h、1000V1h、8000V1h，最后稳定在8000V下进行等电聚焦8h； ⑦平衡 用镊子夹出胶条，超纯水冲洗后，在滤纸上吸干，再以超纯水冲洗，滤纸吸干，然后用镊子夹住胶条以正极端即酸性端向下，负极端即碱性端向上，放入用来平衡的试管中，镊子所夹的是碱性端，酸性端留有溴酚蓝作为标记，用平衡液A和平衡液B先后平衡15min；平衡液A为50mmol Tris‑HCl、pH8.8、6mmol/L尿素、30%甘油、1%SDS、0．2%DTT、0.1%溴酚蓝，平衡液B为50mmol Tris‑HCl、pH8.8、6mmol/L尿素、30%甘油、1%SDS、3%碘乙酰胺、0.1%溴酚蓝； ⑧第二向垂直SDS‑PAGE电泳 将IPG胶条从平衡缓冲液中移出，用镊子夹住胶条的一端使胶面完全浸没在1×电泳缓冲液中；然后将胶条胶面朝上放在SDS‑PAGE凝胶的长玻璃板上，轻轻将胶 条推至SDS‑PAGE凝胶胶面上，SDS‑PAGE凝胶胶面和胶条要紧密结合，再将SDS‑PAGE凝胶转移到灌胶架上，在SDS‑PAGE凝胶的上方加入0.5%低熔点琼脂糖封胶液；5W/胶电泳30min，然后以20W/胶恒功率电泳，直至溴酚蓝指示线到达凝胶底边处停止电泳； ⑨扫描分析图像 Typhoon多功能激光扫描仪扫描SDS‑PAGE凝胶，扫描后的图像用DeCyder2D图像分析软件分析图像，找出差异蛋白点； ⑩加大上样量建立制备胶并用考马斯亮蓝染蓝染液染色 将各组蛋白混合到1000μg，进行双向电泳，再用考马斯亮蓝染蓝染液染色，用ddH2O洗涤两次，每次15min，倒入考马斯亮蓝染蓝染液，考马斯亮蓝染蓝染液为0.25％考马斯亮蓝R‑250溶解于50%甲醇和10%乙酸中；摇染过夜，弃掉考马斯亮蓝染蓝染液，用蒸馏水洗涤3次，再加入10%的乙醇脱色液250ml，摇床上脱色至背景清晰为止，扫描保存图像； （4）质谱分析及验证 选取差异蛋白质点，胶内酶解后进行质谱分析，并对MatrixScience公司的Mascot网上数据库查询，鉴定差异蛋白质，寻找不同来源干细胞的特殊表面标志，然后采用Western‑Blot验证。