水产品中金黄色葡萄球菌的双重PCR-DHPLC检测方法

摘要

一种水产品中金黄色葡萄球菌的双重PCR-DHPLC检测方法，其特征在于包括如下步骤：①金黄色葡萄球菌培养，将待测水产样品与增菌液混合，进行培养；②金葡菌基因组DNA的提取；③引物的设计：④以金葡菌基因组DNA为模板，进行双重PCR扩增；⑤PCR产物的DHPLC检测，得到DHPLC峰型图谱，供分析鉴定。整体检测方法简化了反应的条件，提高了检测的灵敏度，且操作更加简便，达到了高通量的目的。

主权项

一种水产品中金黄色葡萄球菌的双重PCR‑DHPLC检测方法，其特征在于包括如下步骤：①金黄色葡萄球菌培养，将待测水产样品与增菌液混合，进行培养；②金葡菌基因组DNA的提取；③引物的设计：根据Genbank中金葡菌的sea和nuc基因序列，利用Primer5.0软件设计2对特异性引物，如下：sea‑F:5’‑AGTCTGAATTGCAGGGAAC‑3’，sea‑R:5’‑CACCACCATACATACAAGC‑3’；nuc‑F:5’‑CTTGCTATGATTGTGGTAGC‑3’，nuc‑R:5’‑CTAGCAAGTCCCTTTTCCAC‑3’；④以金葡菌基因组DNA为模板，进行双重PCR扩增；⑤PCR产物的DHPLC检测，得到DHPLC峰型图谱，供分析鉴定；于步骤①中所述的金黄色葡萄球菌培养如下：取样品1mL与10mL10%氯化钠胰酪胨大豆肉汤混合，于36℃±1℃培养18h～24h，其中，待测样品与增菌液之间体积配比为1:10；步骤①中所述的金葡菌基因组DNA的提取，如下：取培养后的增菌液1mL，离心，去除上清，得到沉淀用溶葡菌酶进行预处理1h；然后按照细菌DNA提取试剂盒的说明书提取金葡菌基因组DNA；步骤④双重PCR扩增条件如下：双重PCR反应体系：含20mM Mg2+的10×PCR Buffer5μL，10mM的dNTP2μL，两对50μM的引物各0.5μL，2u·μL‑1的Ex Taq酶1μL，模板DNA2μL，最后用ddH2O将反应总体积补足至50μL；双重PCR反应程序：95℃预变性5min；95℃变性45s，60℃退火1min，72℃延伸1min，35个循环，72℃延伸10min，4℃保存；步骤⑤中DHPLC检测如下：PCR产物上样量5μL；色谱柱为PS‑DVB C18DNASep色谱柱，并且，该色谱柱满足4.6mm×50mm，3μm；柱温为50℃；流速为0.9mL/min；流动相：缓冲溶液A体积分数为50.2%，缓冲溶液B体积分数为49.8%；缓冲 液A为50mL TEAA、250μL乙腈，去离子水定容至1000mL，缓冲液B为50mL TEAA、250mL乙腈，去离子水定容至1000mL；检测器为荧光检测器，光源：150W Xenon灯；激发谱带宽：15nm；发射谱带宽：15.3nm；检测灵敏度：在波长350nm积分2s；系统自动按照线性递增的方式将DNASep柱上的DNA分子洗脱下来，在波长260nm处读取吸光值，经系统自动处理后，形成DHPLC峰型图谱。