乳制品病原体检测方法

摘要

本发明公开了一种乳制品病原体检测方法，包括以下步骤：1）设计大肠菌群、乳酸菌、沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、霉菌的对应引物组各一套；2）待测液态乳制品进行前处理，作为DNA模板；3）核酸的恒温扩增：包括设置扩增反应体系、设置阴性对照、设置阳性对照；对上述扩增反应体系、阴性对照和阳性对照分别进行以下操作：先于60~65℃反应30~60分钟；然后使酶失活；4）结果的判读：将步骤3）所得的扩增反应体系、阴性对照和阳性对照各自所得反应液在可见光下直接用肉眼观察，或者在紫外灯照射的状态下用肉眼观察；从而判定待测液态乳制品的检测结果为阴性还是阳性。

主权项

乳制品病原体检测方法，其特征是包括以下步骤：1）、设计引物：设计大肠菌群、乳酸菌、沙门氏菌、志贺氏菌、金黄色葡萄球菌、霉菌的对应引物组各一套；每套引物组中含有4条引物；大肠菌群引物组中的4条引物为：Coli‑BIPAACAAATGCCCTGCTTCCAGGA‑CGGTTTGGGGTACGATTTCGColi‑FIPCTCGTCATCACACCTCAGCGTT‑TTGTCCCGGTTTAAGCATGTColi‑F3 CTATGTTAGCCGGGCGACColi‑B3    TCTACCTGACCACCTGTGT    ；乳酸菌引物组中的4条引物为：Lac‑BIPCTGGGGAGTACGACCGCAAG‑AAACCACATGCTCCACCGLac‑FIPTGAAGGGCGGAAACCCTCCA‑ATACCTGGTAGTCCATGCCGLac‑F3   CATGGGTAGCGAACAGGATTLac‑B3   TCTTCGCGTTGCTTCGAATT    ；沙门氏菌引物组中的4条引物为：Sal‑BIP GCGGCCTGCGAAGCGATATC‑TATCCACAGCGTGTCCCGSal‑FIP   GCGACATCACTTTCCTCCCGC‑TCTCATGAGTCTGCCGTGGSal‑F3   ATTGCTCAGAACGCACTACASal‑B3   GGGTGAAGCGGTAAAACAGA志贺氏菌引物组中的4条引物为：Shi‑BIP    CTGGGACATATCCCTCCGGCA‑CAGGTTGCCAGATCATCGTShi‑FIP   CGTGGTGTGCCCATAGACTCCT‑TATGGAGGGCCCATAGACAAShi‑F3    GACCCCATAAAGCTGGACAGShi‑B3    GCCCCGAGTTTCCTAGAGAA      ；金黄色葡萄球菌引物组中的4条引物为：SA‑BIP   AACGCATTAAGCACTCCGCCT‑GGGTCCCCGTCAATTCCTSA‑FIP   CACTAAGGGGCGGAAACCCC‑CTGGTAGTCCACGCCGTASA‑F3  CGTGGGGATCAAACAGGATTSA‑B3  CATGCTCCACCGCTTGTG霉菌引物组中的4条引物为：mold‑BIPACTGATACGGGGCTCTTTTGGG‑GCCCTCCAATTGTTCCTCGmold‑FIPACCTCCCCGTATCGGGATTGG‑TGAGAAACGGCTACCACATCmold‑F3AGGGTTCGATTCCGGAGAGmold‑B3GAATTACCGCGGCTGCTG      ；2）、 待测液态乳制品的前处理，依次进行以下步骤：①、将待测液态乳制品于3~5℃下1000‑2000rpm离心15~25min，弃上层悬浮物；②、在上述步骤的所得物中加入PBS，轻轻震荡从而使沉淀重新悬浮，于3~5℃下1000~2000rpm离心15~25min，弃上层悬浮物；所述PBS与步骤①中的待测液态乳制品的体积比为8~12:50；③、重复步骤②2次；4000~6000g离心8~12min，弃上清；得沉淀；④、按照TEN：1N的 NaOH溶液为22:2.8~3.2的体积比，在步骤③所得的沉淀中加入TEN和1N的 NaOH溶液，直至沉淀完全悬浮；所述TEN为：每100ml的TEN中含有0.9~1.1ml的pH 7.2的浓度1M 的Tris、0.18~0.22 mL的pH 8.0的浓度0.5M的 EDTA，0.58~0.60g的NaC1；其余为水；⑤、先将步骤④的所得物于90~100℃加热7~9 min，然后冷却至≤室温；⑥、将部分的步骤⑤所得物进行DNA浓度检测，其余的步骤⑤所得物于－20℃保存备用，作为DNA模板；3）、核酸的恒温扩增：利用步骤1）所得的每套引物组分别进行以下操作：①、步骤1）所得的每套引物组中的引物用DEPC处理水进行溶解稀释；②、设置扩增反应体系：2×反应液（RM）*  12.5µl，Bst DNA聚合酶1µl， 4种引物各1µl，DNA模板2µl，荧光染料1µl，DEPC处理水4.5µl；总反应体系为25µl；所述2×反应液（RM）*购自北京蓝谱生物科技有限公司，货号为LMP221；所述荧光染料购自北京蓝谱生物科技有限公司，货号为LMP204；③、设置阴性对照：以同体积量的DEPC处理水代替步骤②扩增反应体系中的DNA模板，作为阴性对照；④、设置阳性对照：以同体积量的所述引物组所对应菌的标准DNA代替步骤②扩增反应体系中的DNA模板，作为阳性对照；⑤、上述扩增反应体系、阴性对照和阳性对照分别进行以下操作：先于60~65℃反应30~60分钟；然后使酶失活；4）、结果的判读：步骤3）所得的扩增反应体系、阴性对照和阳性对照各自所得反应液分别按照以下任一方式进行操作：方式一、①、将步骤3）所得的扩增反应体系、阴性对照和阳性对照各自所得反应液在可见光下直接用肉眼观察，比较扩增反应体系反应液、阴性对照反应液和阳性对照反应液的混浊程度；当同时满足阴性对照反应液为澄清透明、且阳性对照反应液为白色混浊时，进入步骤②，否则进入步骤③；②、进行样品的判定：当扩增反应体系反应液为澄清透明时，则待测液态乳制品的检测结果为阴性；待测液态乳制品中不含有所述引物组所对应的菌；当扩增反应体系反应液为白色混浊时，则待测液态乳制品的检测结果为阳性；待测液态乳制品中含有所述引物组所对应的菌；③、检测失败，需要重新进行检测；方式二、①、将步骤3）所得的扩增反应体系、阴性对照和阳性对照各自所得反应液在紫外灯照射的状态下用肉眼观察，比较扩增反应体系反应液、阴性对照反应液和阳性对照反应液的混浊程度；当同时满足阴性对照反应液为澄清透明、且阳性对照反应液出现强烈的蓝色荧光时，进入步骤②，否则进入步骤③；②、进行样品的判定：当扩增反应体系反应液为澄清透明时，则待测液态乳制品的检测结果为阴性；待测液态乳制品中不含有所述引物组所对应的菌；当扩增反应体系反应液出现强烈的蓝色荧光时，则待测液态乳制品的检测结果为阳性；待测液态乳制品中含有所述引物组所对应的菌；③、检测失败，需要重新进行检测。