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一种突触核蛋白内含子1甲基化水平检测方法，其特征在于：a、亚硫酸氢钠处理：用偏重亚硫酸氢钠和对苯二酚对基因组DNA进行处理修饰，将未甲基化的胞嘧啶脱氨基转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变；基因组DNA使用0.3mol/L NaOH变性；而后使用偏重亚硫酸氢钠与对苯二酚混合溶液(pH 5.0)于50℃处理基因组DNA 16h； 用试剂盒纯化DNA，并加入0.3 mol/L NaOH于37℃孵育15min终止反应，最后乙醇沉淀DNA；b、PCR扩增：按常规方法进行PCR扩增，引物及反应条件如下：正向扩增引物：GAA,ATG,GAA,GTG,TAA,GGA,GGT,T ；反向扩增引物：Biotin‑TTC,TAA, TCC,ATC,CAA,CAT,CCA,C ；扩增条件：94°C预变性2min； 94°C变性20s，58°C退火20s， 72°C延伸20s，共50循环；最后72°C延伸5min；c、单链制备：用链霉亲和素偶连的琼脂糖珠吸附生物素标记的PCR产物，通过NaOH变性来制备单链DNA ；d、焦磷酸测序样本制备：经变性的单链DNA和测序引物在80℃加热结合成杂交体，冷却成为焦磷酸测序样本，测序引物S1为：AGG,AGG,TTA,AGT,TAA,TAG,GT； 测序引物S2为：GTT,AGG,GTG,GAG,GTT,GAG,AA；e、焦磷酸测序分析前准备：测序样本加入酶的混合物和底物混合物进行反应；每一轮测序反应中，加入1种dNTP，若该dNTP与模板配对，聚合酶就可以将其掺入到引物链中并释放出等摩尔数的焦磷酸基团‑‑‑PPi；硫酸化酶催化APS和PPi形成ATP，后者驱动荧光素酶介导的荧光素向氧化荧光素的转化，发出与ATP量成正比的可见光信号，并由软件转化为一个峰值，峰值高度与反应中掺入的核苷酸数目成正比；根据加入dNTP类型和荧光信号强度可实时记录模板DNA的核苷酸序列；其中酶的混合物是DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶、双磷酸酶混合，底物混合物是受质APS和荧光素混合；f、用计算机软件分析计算出相应位点的甲基化状态。 |
