猪圆环病毒2型细胞悬浮培养生产方法

摘要

本发明公开了一种猪圆环病毒2型细胞悬浮培养生产方法，本发明包含猪圆环病毒2型病毒生物反应器微载体悬浮培养带毒细胞制备猪圆环病毒2型灭活疫苗的生产工艺。本发明可以大量降低生产成本，投入产出比提高5-10倍；而且生产周期短2-3天，占用场地小，同样产量下，占底面积仅为传统转瓶工艺的1/5，易于快速扩大生产规模，全密闭罐体生产条件下环境污染少且易于处理，自动化程度高，用人少，质量易于实现均衡稳定；可显著降低生产成本、提高疫苗产量和质量。

主权项

一种通过悬浮培养PK‑15细胞生产猪圆环病毒2型的方法，其特征在于： 选择生物反应器作为培养工具；选择微载体作为细胞贴附的生长载体；选择PK‑15克隆细胞接毒制备的带毒细胞作为制苗用细胞；并包括如下步骤： （1）、带毒细胞的制备和扩增 将细胞状态良好长为单层的健康pK‑15克隆细胞消化传代后按照细胞培养体积的1%‑5%接种PCV2种毒，培养24‑48h待细胞长满50%以上后，换含MEM维持液继续维持48h，待细胞长满后即得到带毒细胞F1代； （2）、带毒细胞在转瓶上的培养 利用预热的无菌PBS将长满的带毒细胞F1代轻轻洗涤一次，加入15‑20ml胰酶消化液消化，不断旋转转瓶直至细胞全部消化脱落，加入MEM生长液终止消化，摇匀，按照1:2至1:5的传代比例分瓶；传代后代次为F2，依次类推； （3）、带毒细胞在生物反应器上的培养 在生物反应器中将Cytodex‑1微载体的密度设定为3‑5g/L，准备好后备用； 将带毒细胞传代至F3代时挑选状态良好的细胞接种生物反应器，接种的密度为3‑4×105个/ml，接种后采用搅拌10‑15min，停止10‑15min的方法周期间歇性的搅拌维持2h促进细胞贴壁；更换MEM维持液在pH7.4‑7.6，DO为50%‑70%，搅拌转速为40‑50rpm的条件下继续培养； （4）、病毒的收获和效价测定 所述更换MEM维持液在pH7.4‑7.6，DO为50%‑70%，搅拌转速为40‑50rpm的条件下继续培养50h后静置，吸出上清收获，继续加入的MEM维持液培养40h，观察若细胞大部分已脱落则连同微载体一起全部收获，若细胞状态依然较好则继续收获上清，添加MEM维持液再收获一次，至最后一次收获时连同微载体上的细胞一同收获，反复冻融2‑3次后作为半成品测定效价。