预防山羊葡萄球菌乳房炎的亚单位疫苗的制备方法及应用

摘要

本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及一种预防山羊葡萄球菌乳房炎的亚单位疫苗的制备方法及应用。本发明的目的在于提供预防山羊葡萄球菌乳房炎的亚单位疫苗的制备方法及应用，亚单位疫苗与致病菌的自然感染过程相似，可促进粘膜免疫，诱导免疫记忆和引起广泛的免疫应答，产生很好的交叉保护反应，是一种更加安全稳定、制备简单、应用方便、价格低廉的新型疫苗。本发明通过以下步骤完成：1）金黄色葡萄球菌保护性抗原的表达与纯化；2）重组蛋白与转移因子佐剂的混合。

主权项

一种预防山羊葡萄球菌乳房炎的亚单位疫苗的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：1）金黄色葡萄球菌保护性抗原的表达与纯化；2）重组蛋白与转移因子佐剂的混合；将ClfA、Hla及Sbi三种蛋白的功能区通过原核表达并纯化，制成多价亚单位疫苗，且ClfA的A区、Sbi的Ⅰ‑Ⅳ区为配体结合区；步骤1）中包括：①设计引物；②制备模板；③PCR扩增与回收目的基因；④目的基因的原核表达与纯化；①设计引物根据Genebank上已经提交的ClfA、Hla及Sbi基因序列分别设计引物H1/H2、C1/C2和S1/S2，并加入相应的酶切位点：序列：ClfA    Genbank No.AB245457.1 Hla     Genbank No.AY449760.1Sbi     Genbank No.AB050860.1H1:5'‑CGGAATTCGCAGATTCTGA‑3'                EcoRIH2: 5'‑GCCTCGAGTTAATTTGTCAT ‑3'             XhoI C1: 5'‑CGGAATTCGTAGCTGCAGAT‑3'              EcoRIC2: 5'‑CCGCTCGAGCTCATCAGGTTGTTCAGG‑3'       XhoI  S1: 5'‑CGGAATTCGATCAACAAAAAGCTT‑3'          EcoRIS2: 5'‑CGCTCGAGTAATGCGTCTAATTGTTT‑3'        XhoI②制备模板提取DNA模板所用的金黄色葡萄球菌分离自患临床乳房炎的奶山羊乳样，均匀涂抹乳样于血琼脂平板，37℃温箱中过夜培养，挑取溶血性菌于显微镜下观察细菌形态，确定为金黄色葡萄球菌后再挑取菌落于5 mL LB液体培养基中，37℃摇床中培养过夜，取1 mL菌液，用细菌基因组DNA快速抽提试剂盒提取金黄色葡萄球菌基因组DNA， ‑20℃保存备用；③PCR扩增与回收目的基因（1）扩增目的基因hla反应体系50 μL：超纯水32 μL，10 × Taq Buffer 5 μL，dNTP 混合物 4 μL，MgCl24 μL，H1/H2各1 μL，模板2 μL，Taq酶1 μL，加样后充分混匀；PCR程序：预变性94℃ 5 min；进入循环：变性94℃ 30 s，退火56℃ 30 s，延伸72℃ 1.5 min，共30个循环；最终延伸72℃ 10 min；（2）扩增目的基因ClfA的A区反应体系50μL：超纯水32 μL，10 × Taq Buffer 5 μL，dNTP 混合物 4 μL，MgCl2 4 μL，C1/C2各1 μL，模板2 μL，Taq酶1 μL，加样后充分混匀；PCR程序：预变性94℃ 5 min；进入循环：变性94℃ 30 s，退火55℃ 30 s，延伸72℃ 1.5 min，共30个循环；最终延伸72℃ 10 min；（3）扩增目的基因Sbi的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ区反应体系50μL：超纯水32 μL，10×Taq Buffer 5μL，dNTP 混合物 4μL，MgCl2 4μL，S1/S2各1μL，模板2μL，Taq酶1μL，加样后充分混匀；PCR程序：预变性94℃ 5min；进入循环：变性94℃ 30s，退火52℃ 30s，延伸72℃ 1min，共30个循环；最终延伸72℃ 10min；（4）回收PCR扩增产物目的基因经琼脂糖凝胶电泳、溴化乙锭显色并切胶后，用胶回收试剂盒回收PCR扩增产物， ‑20℃保存备用；④目的基因的原核表达与纯化（1）表达载体的构建分别用限制性内切酶EcoRI和Xho I对目的基因的扩增产物和表达载体pET32a进行双酶切；酶切体系40μL：PCR产物或pET32a载体32μL，10×H Buffer 4μL，EcoRI / XhoI各2μL；混匀后置于37℃水浴反应2～3h，目的基因和表达载体pET32a的酶切产物经核酸电泳鉴定纯化后回收，然后将二者混合于16 ℃过夜连接，得到重组质粒pET‑Hla、pET‑CA、pET‑Sbi，产物4℃保存；连接反应体系：T4 Ligase Buffer 1μL，目的片段酶切产物6.5μL，pET32a 载体酶切产物1.5μL，T4 DNA Ligase1μL；将连接产物转化入感受态细胞BL21（DE3），在Amp+平板上37℃培养12 h后挑取阳性质粒做菌液PCR鉴定、双酶切鉴定和测序鉴定；（2）重组质粒的诱导表达将上步筛选出的阳性重组菌按1:100接种到含氨苄的LB 培养基中，转速为220r/min、37℃震荡培养至OD600=0.8～1.0时，加入IPTG诱导目的蛋白，诱导条件分别如下：pET‑Hla：IPTG终浓度为0.5mmol/L，37℃，6h；pET‑ClfA：IPTG终浓度为0.5mmol/L，37℃，2h；pET‑Sbi：IPTG终浓度为0.5mmol/L，37℃，4h；表达产物用SDS‑PAGE电泳检测；（3）目的蛋白的纯化收集诱导后的菌体，用PBS（pH7.4）洗涤2次后用重悬，冰上超声裂解细菌，至样品不再黏稠，裂解物12000r/min，4℃离心5min，收集上清，用镍柱纯化法纯化上清，得到目的蛋白，纯化产物用SDS‑PAGE电泳检测。