一种微生物体内合成生物柴油的方法

摘要

一种微生物内合成生物柴油的方法，在大肠杆菌中实现，其步骤为：分别将不动杆菌蜡脂合成酶基因atfA、大肠杆菌脂酰辅酶A合成酶基因fadD、运动发酵单胞菌的丙酮酸脱羧酶基因pdc和乙醇脱氢酶基因adhB四个基因串联克隆到pET表达载体上得到质粒pXT11；将pXT11转入到含有质粒pMSD8和pMSD15的大肠杆菌得到大肠杆菌菌株XT31；大肠杆菌XT31生产生物柴油。本发明实现了由糖到生物柴油的微生物转化，为木质纤维素生物质制备生物柴油奠定了基础，从根本上解决生物柴油制备中原料供应不足的问题；该技术也不需要经过甲醇酯化的步骤，所以大大降低了成本，也没有甘油副产物形成等问题。

主权项

一种微生物体内合成脂肪酸乙醇酯的方法，主要步骤为：A)分别将atfA、fadD、pdc和adhB基因克隆于pET28b载体上(1)质粒pXL67是atfA基因通过NdeI和SpeI克隆于pET28b载体的而得到的；而质粒pXL72是fadD基因克隆于pCR‑blunt载体上得到的；pYL6和pYL5则是pdc和adhB基因分别克隆于pMD18‑T载体上得到的；(2)质粒pXT1是以XbaI完全酶切pYL6，然后用T4DNAPolymerase将粘性末端补平，最后让DNA片段自连接，转化大肠杆菌而得到的；(3)以NdeI和SpeI酶切质粒pXL72、pXT1和pYL5，分别将fadD、pdc和adhB基因片段切下回收；(4)而pXL67也以NdeI和SpeI酶切，回收pET载体片段；(5)分别将回收后的fadD、pdc和adhB基因片段与pET载体片段相连接，转化大肠杆菌DH5α，经过抗性筛选酶切鉴定得到质粒pXT3、pXT4和pXT5；B)atfA和fadD基因，pdc和adhB基因分别串联克隆于pET载体上(1)以SpeI酶切质粒pXL67，回收线性DNA片段，再以碱性磷酸酶FastAP处理，回收pXL67载体片段；而质粒pXT3经XbaI和SpeI酶切后，回收fadD基因片段；将fadD基因片段和pXL67载体片段相连接，转化大肠杆菌，再通过提质粒酶切筛选鉴定fadD片段正向插入的克隆，即得到质粒pXT9；(2)按照上面同样的方法，以SpeI酶切质粒pXT4，回收线性DNA片段，再以碱性磷酸酶FastAP处理，回收pXT4载体片段；而质粒pXT5经XbaI和SpeI酶切后，回收adhB基因片段；将adhB基因片段和pXT4载体片段相连接，转化大肠杆菌，再通过提质粒酶切筛选鉴定adhB片段正向插入的克隆，即得到质粒pXT10；C)atfA、fadD、pdc和adhB基因串联克隆于pET载体上以SpeI和XhoI酶切质粒pXT9，回收载体片段；然后，以XbaI和XhoI酶切质粒pXT10，回收pdc+adhB基因片段；最后，pdc+adhB基因片段和pXT9载体片段相连接，转化大肠杆菌，就得到了四个基因串联于 pET载体上的质粒pXT11；质粒pXT11转化含有pMSD8和pMDS15两个质粒的大肠杆菌；D)步骤C得到的大肠杆菌菌株经过IPTG和阿拉伯糖诱导产生脂肪酸乙醇酯。