一种添加扩增内标的食品中猪肉或鸡肉成分Taqman探针荧光定量PCR快速检测方法

摘要

本发明公开了一种添加扩增内标的食品中猪肉或鸡肉成分Taqman探针荧光定量PCR快速检测方法。具体方法为：分别基于动物细胞核基因设计引物和探针；人工合成一段竞争型扩增内标及相应的探针，建立内标荧光定量PCR体系，应用ABI 7500 Software SDS 1.4对实验结果进行分析处理，以Ct值小于36的扩增作为检测的阳性结果。本发明检测方法具有良好的针对目标物种的特异性的同时通过实时监控PCR反应以避免假阴性检测结果的产生，为食品中动物源性成分鉴定探索了新的途径，具有准确稳定、操作方便等有益效果。

主权项

一种添加扩增内标的食品中猪肉或鸡肉成分Taqman探针荧光定量PCR快速检测方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）应用根据猪的beta actin 基因或鸡的transforming growth factor 基因设计扩增引物和Taqman探针，分别使用荧光基团FAM、HEX作为探针的发光基团；（2）设计构建含有阳性扩增内标DNA的重组质粒并设计相应探针；（3）以含有待检DNA模板，含有阳性扩增内标DNA的重组质粒，阳性扩增内标DNA的Taqman探针，以及设计合成的猪beta actin 基因扩增引物和Taqman探针，或鸡transforming growth factor 基因扩增引物和Taqman探针的荧光定量PCR反应体系进行荧光定量PCR反应；（4）应用ABI 7500 Software SDS1.4对实验结果进行分析处理，以Ct值小于36的扩增作为检测的阳性结果；其中步骤（2）所述的设计构建含有阳性扩增内标DNA的重组质粒的方法为：使用DNA随机生成软件产生一段DNA序列，使其在NCBI中Blast后没有出现与之同源的DNA片段，在这段随机DNA序列上、下游分别连接上目标物种的扩增引物序列，从而形成针对猪检测体系和鸡检测体系长度分别为98bp和94bp的阳性扩增内标DNA序列；将这两段扩增内标DNA序列委托人工基因合成，合成片段分别连接载体pGH，转化感受态细胞DH5α，小量提取并测序验证，得到分别针对猪肉和鸡肉检测体系的含有阳性扩增内标DNA的重组质粒；其中，猪beta actin 基因扩增上游引物为SEQ ID NO.1，下游引物为SEQ ID NO.2，探针为5’‑FAM‑ACAGTAGGTCTGACGTGACTCCCCGA‑BHQ1‑3’；鸡transforming growth factor 基因扩增上游引物为SEQ ID NO.3，下游引物为SEQ ID NO.4，探针为5’‑HEX‑CTGCCAAGCTCTGCCACTCCTCTG‑BHQ1‑3’；针对猪检测体系的阳性扩增内标DNA序列：SEQ ID NO.5；针对鸡检测体系的阳性扩增内标DNA序列：SEQ ID NO.6；阳性扩增内标DNA的Taqman探针为: 5’‑CY5‑ATGACCAAAGCCTCCGGGCGTAG‑BHQ3‑3’。2. 根据权利要求1所述的一种添加扩增内标的食品中猪肉或鸡肉成分Taqman探针荧光定量PCR快速检测方法，其特征是，所述荧光定量PCR反应体系为：20μL反应体系包含：模板DNA 和含有阳性扩增内标DNA的重组质粒各2μL，Premix Ex Taq 10μL，10μM靶基因探针溶液和10μM扩增内标探针溶液各0.8μL，ROX校正溶液0.4μL，猪和鸡扩增体系中引物浓度分别为0.2μM和0.6μM。3. 根据权利要求1所述的一种添加扩增内标的食品中猪肉或鸡肉成分Taqman探针荧光定量PCR快速检测方法，其特征在于，所述荧光定量PCR反应条件为：95℃30s，40 个循环的95℃5s 和60℃34s。4. 权利要求1所述的一种添加扩增内标的食品中猪肉或鸡肉成分Taqman探针荧光定量PCR快速检测方法在食品质量控制和质量安全检测中的应用。