MicroRNA-29a通过KLF4促进结直肠癌远处转移的方法

摘要

本发明公开了一种MicroRNA-29a通过KLF4促进结直肠癌远处转移的方法，包括以下步骤：（1）准备组织样本；（2）RNA抽提和实时定量逆转录PCR；（3）细胞培养和转染；（4）荧光素酶试验；（5）蛋白免疫印迹；（6）细胞侵袭和（7）统计学分析。结直肠癌（CRC）组织中miR-29a表达与CRC远处转移相关，miR-29a表达上调提示不良预后，且miR-29a表达上调联合KLF4表达下调进一步提示不良预后。机制研究显示miR-29a通过作用于KLF4促进CRC细胞侵袭。这将为miR-29a在CRC患者中的预后评估以及miR-29a抑制剂用于治疗CRC远处转移提供理论基础。

主权项

一种MicroRNA‑29a通过KLF4促进结直肠癌远处转移的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）准备组织样本（1.1）收集标本收集结直肠癌（CRC）离体后的组织标本，立即经液氮速冻，并保存在‑80℃冰箱；（1.2）病理学诊断每个标本都经组织病理学诊断；（2） RNA抽提和实时定量逆转录PCR（3） 细胞培养和转染（3.1）人CRC细胞系HCT‑116和LoVo分别维持在McCoy’s 5a和F12‑K培养基中；（3.2）准备MiR‑29a mimics、anti‑miR‑29a以及KLF4小干扰RNA；（4） 荧光素酶试验 以人结直肠正常粘膜组织基因组DNA为模板，PCR扩增KLF4 3’UTR，构建荧光素酶报告基因质粒pGL3‑3’UTR WT；再以pGL3‑3’UTR WT为模板通过点突变试剂盒，构建突变型荧光素酶报告基因质粒pGL3‑3’‑UTR Mut；（5） 蛋白免疫印迹细胞裂解采用SDS‑PAGE上样缓冲液；等量的蛋白在10% SDS‑PAGE胶中进行电泳，并转移至醋酸纤维素膜上；经5%牛奶封闭后，醋酸纤维素膜与以下抗体4℃孵育过夜；Anti‑KLF4，anti‑GAPDH.GAPDH作为样本间的对照；蛋白最后进行ECL 显影；（6） 细胞侵袭Transwell小室用于分析细胞的侵袭能力；小室预先包被Matrigel胶4小时；转染48小时后，细胞经含1%FBS的培养基重悬，并添加到小室的上室；置于细胞培养箱中培养既定时间后，上室的细胞被移去，经4%PFA固定，Hoechst 33342染色后，在荧光显微镜下拍照和记数； （7） 统计学分析统计分析采用SPSS 15.0，采用Mann‑Whitney U检验比较不同组间miR‑29a表达水平的差异，采用t检验比较不同组间的细胞侵袭的差异，P<0.05。