主权项 |
一种牛CSRP3基因单碱基突变的检测方法,其特征在于,以包含CSRP3基因的待测秦川肉牛和中国荷斯坦奶牛全基因组DNA序列为模板,设计CSRP3基因特异性引物,在PCR反应程序下进行扩增,扩增后的特异性PCR产物经检测出现目的带时,直接用限制性内切酶HhaI消化PCR产物,然后再进行琼脂糖凝胶电泳,电泳结果发现3种不同条带,分别对应着3种不同基因型,挑取不同带型送测序验证,利用生物信息学方法,将测序结果与NCBI公布的序列进行比较,发现该CSRP3基因第2外显子区域即第14832位发生了A>T突变; 所述的牛CSRP3基因特异性引物为:上游引物CSRP3‑GSP‑F: 5'‑ CACAGGTCAGGAATCAAAG ‑3' 19bp;下游引物CSRP3‑GSP‑R: 5'‑ GCAAAGGTCAAACAATAGG ‑3' 19bp;所述的PCR 反应体系为:总反应体系为15 μL,其中包括2×Reaction Mix 7.5 μL,ddH2O 6.1 μL,上游引物CSRP3‑GSP‑F 0.3 μL,下游引物CSRP3‑GSP‑R 0.3 μL,Golden DNA polymerase 0.3 μL,含CSRP3基因序列的DNA模板0.5 µL;所述的PCR反应程序为:95℃预变性5 min,94℃变性30 s,60℃退火40 s,72℃延伸40 s,共36个循环,72℃充分延伸10 min,最后16℃保存待用。 |