一种原料乳和乳制品中总蛋白含量的酶联免疫检测方法及试剂盒

摘要

本发明公开了一种用于检测原料乳和乳制品中总蛋白含量的酶联免疫检测方法及试剂盒，属于食品安全领域。具体为，酶标板包被两种蛋白抗原，加入两种蛋白混合标准品或样品，再加入两种蛋白混合抗体后，游离的蛋白与酶标板上包被的蛋白竞争抗体，洗涤除去未与酶标板上蛋白连接的抗体，并加入HRP-羊抗兔抗体，反应后，洗涤除去未连接的二抗；加显色液、终止液后，酶标仪测定其吸光度值，对照标准曲线，可得样品中酪蛋白和β-乳球蛋白总含量，根据比例，计算得到牛乳制品中总蛋白含量。本试剂盒是检测方法的一种实现形式，该检测方法具有高特异性、高灵敏度、定量准确、简便等优点，检测线可达108ng/ml，适用于大批样品现场快速检测。

主权项

一种对原料乳和乳制品中总蛋白含量的酶联免疫检测方法，包括以下步骤：(l)包被：Na2CO3‑NaHCO3缓冲液，稀释混合蛋白配制混合蛋白包被液，包被96孔酶标板，每孔100μL，4℃放置8小时以上；(2)封闭：弃去包被液，每孔加入150μL封闭液，放置恒温恒湿细胞培养箱37℃，孵育2h以上；(3)抗原抗体反应：弃去封闭液，用洗涤液PBST洗涤；将混合蛋白梯度标准品或待测样品加入酶标板微孔，每孔50μL；再加入混合蛋白抗体，每孔50μL，37℃恒温恒湿培养箱，孵育0.5h以上；(4)抗原抗体复合物与酶标二抗反应：弃去反应液，酶标板用PBST洗涤，加入酶标二抗，每孔100μL，37℃恒温恒湿培养箱，孵育0.5h以上；(5)显色：弃去反应液，用PBST洗涤，显色液A与显色液B按600～700:1比例混合，每孔加入100μL混合显色液，恒温恒湿培养箱37℃，孵育25min；显色液A为10mg邻苯二胺溶于25mL0.05M的磷酸盐一柠檬酸缓冲液，pH值为5.0；显色液B为40%双氧水；(6)终止反应：酶标板每微孔加入50μL的l～2mol/L盐酸，终止反应；(7)测定：用酶标仪于492nm波长下测量各孔的吸光度值OD值；(8)根据检测结果绘制标准曲线，横坐标为各标准混合蛋白浓度的对数，纵坐标为抑制率；所述抑制率为各标准品孔和样品孔吸光度值除以0ng/mL标准品孔吸光度值；(9)对照标准曲线，带入线性回归方程，得到酪蛋白和β‑乳球蛋白的总含量，根据酪蛋白和β‑乳球蛋白占全蛋白的含量，得到全蛋白含量；所述步骤(1)中，稀释混合蛋白包括4～5μg/mL酪蛋白和2～2.5μg/mLβ‑乳球蛋白混合液，混合比例：2:1；所述步骤(2)中，封闭液为5%(w/w)以上的豆粉，进行超声3min以上，2000rpm离心5min以上，取上清得到；所述步骤(3)中，混合蛋白抗体为酪蛋白抗体和β‑乳球蛋白抗体以等比例混合制备的混合蛋白抗体，混合比例为1:1；混合蛋白标准品为酪蛋白和β‑乳球蛋白标准品按8:1浓度比例混合，逐级稀释成140.6ng/mL、281.2ng/mL、562.5ng/mL、1125ng/mL、2250ng/mL、4500ng/mL、9000ng/mL、18000ng/mL、36000ng/mL、72000ng/mL，稀释液为PBST；洗涤液为含有吐温20的磷酸盐缓冲液PBST；所述步骤(4)中，酶标二抗为辣根过氧化物酶标记的羊抗兔lgG。