促血管再生或新生的制剂及其制备方法

摘要

本发明涉及一种促进血管组织再生或新生的制剂及其制备方法，该制剂的制备方法是通过诱导单核细胞获得血管内皮祖细胞(endothelial progenitor cells，EPC)，进而在低血清及低氧条件培养上述EPC细胞，最后分离EPC细胞获得无细胞培养基，并对该无细胞培养基进行相应后处理，即可获得所述制剂。体外和体内实验表明，本发明所述的促进血管组织再生或新生的制剂能够显著的促进血管组织的新生或受损血管组织的修复。

主权项

一种促进血管再生或新生的制剂的制备方法，其特征在于，该制剂的制备方法包括如下步骤：步骤1).从健康人血液中通过密度梯度离心的方法获取外周血单细胞，密度梯度离心获取外周血单细胞的方法为：使用梯度剂Histopaque～1077，温度为常温，离心力为400g，时间30分钟，离心完成后，吸取当中不透明层，即为单核细胞悬液；步骤2).培养单核细胞以获得EPC细胞，所用的培养基为EBM‑2，并添加有1％的生长因子添加剂EGM；培养基中另含有质量比为10％的人血清白蛋白；培养条件为温度37℃，二氧化碳浓度为5％；培养方法为以下所述方法①、②、③或④中的一种：方法①：将单核细胞以每平方厘米5×105至2×106个细胞的密度培养2‑4天，将贴壁细胞用胰蛋白酶消化收集后以每平方厘米1×105至2×105个细胞的密度重新培养3‑7天，获I型EPC细胞；方法②：将单核细胞以每平方厘米5×105至2×106个细胞的密度培养2天，收集悬浮细胞，并以每平方厘米1×105至2×105个细胞的密度重新培养3‑7天，获II型EPC细胞；方法③：将单核细胞以每平方厘米5×105至2×106个细胞的密度培养1‑6天，将贴壁细胞用胰蛋白酶消化收集后以每平方厘米1×105至2×105个细胞的密度重新培养10‑21天，获III型EPC细胞；方法④：将单核细胞通过CD34特异性抗体进行磁珠分选，筛选出富含CD34+的单核细胞亚群，将此CD34+单核细胞亚群在步骤2)中所描述的培养基及培养条件下以每平方厘米1×105至1×106个细胞的密度培养2‑6天，获IV型EPC细胞；步骤3).在特定条件下培养EPC细胞使其分泌促血管生成的生长因子和细胞活素，分离EPC细胞和培养基，获得富含促血管生成因子和细胞活素的无细胞培养基；培养EPC细胞的方法为：在氧浓度为0.5％至2％的环境中培养1至3天，所用的培养基为M119、DMEM、RPMI‑1640、EBM、EBM‑2、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液(PBS)或0.9％的医用生理盐水，并添加1％的医用人血清白蛋白；步骤4).对步骤3)中所获得的无细胞培养基进行后处理，该后处理步骤包括：过滤细胞碎片、纯化该无细胞培养基、检测各有效生长因子成分及含量、对该培养基进行冻干处理或冷冻保存，即获得促血管再生或新生制剂。