一步法构建携带外源基因的D24纤维蛋白修饰的条件复制型腺病毒载体及其应用

摘要

本发明公开了一种一步法构建携带外源基因的D24纤维蛋白修饰的条件复制型腺病毒载体及其应用，在Ad5 D24条件复制型腺病毒载体基础上，经过以下两方面的改造以提高这类载体插入外源基因的构建效率：(1)突变腺病毒基因组上的BamHI位点；(2)通过同源重组的方法在fiber和E4之间引入BamHI和SfuI，从而可以通过酶切连接的方法一步将外源基因引入腺病毒基因组中。得到的携带外源基因的D24纤维蛋白修饰的条件复制型腺病毒载体经药效试验，证明携带外源基因的D24纤维蛋白修饰的条件复制型腺病毒载体可提高对肿瘤的治疗效果。

主权项

一种一步法构建的携带外源基因的D24纤维蛋白修饰的条件复制型腺病毒载体，其特征在于，所述的腺病毒载体是HB D24‑5/11‑TRAIL/eGFP，具体如下：(1)在人腺病毒载体5型基因组中第922bp～947bp之间缺失的24 碱基序列，该缺失的24bp碱基序列为：cttacctgccacgaggctggcttt；(2)在人腺病毒载体5型基因组中31042bp处即纤维蛋白Tail处，插入一个修饰的纤维蛋白5/11，其插入的序列为：Atgaagcgcgcaagaccgtctgaagataccttcaaccccgtgtatccatatgacacggaaaccggtcctccaactgtgccttttcttactcctccctttgtatcccccaatgggtttcaagagagtccccctggtcttactttaaaatgtttaaccccgctaacaaccacaggcgggtctctacagctaaaagtgggagggggacttacagtagatgacactgatgggaccttacaagaaaacataggtaccaccacaccacttgttaagactgggcactctataggtttatccctaggagccggattgggaacagatgaaaataaactttgtaccaaattgggaaaaggacttacattcaattcaaacaacatttgcattgatgacaatattaacaccctgtggacaggaattaaccccaccgaagccaactgtcaaatgatggactccagtgaatctaatgattgcaaattaattctaacactagttaaaactggagccctagtcactgcatttgtttatgttataggagtatctaacaattttaatatgctaactacatacagaaatataaattttactgcggagctgttttttgattctgcgggtaatttactaactagcctgtcatccctaaaaactccacttaatcataaatcaggacaaaacatggctactggtgccattactaatgctaaaagtttcatgcccagcacaactgcttatcctttcaataataattctagagaaaaagaaaactacatttacggaacctgtcactacacagctagtgatcacactgcttttcccattgacatatctgtcatgcttaaccaaagagcaataagagctgatacatcatattgtattcgtataacttggtcctggaacacaggagatgccccagaggggcaaacctctgctacaaccctagttacctccccatttaccttttactacatcagagaagacgactga；(3) 在人腺病毒载体5型基因组中32021bp～32022 bp之间插入双表达TRAIL 与eGFP的表达元件，其序列如下：agatctccatagagcccaccgcatccccagcatgcctgctattgtcttcccaatcctcccccttgctgtcctgccccaccccaccccccagaatagaatgacacctactcagacaatgcgatgcaatttcctcattttattaggaaaggacagtgggagtggcaccttccagggtcaaggaaggcacgggggaggggcaaacaacagatggctggcaactagaaggcacagtctagattacttgtacagctcgtccatgccgagagtgatcccggcggcggtcacgaactccagcaggaccatgtgatcgcgcttctcgttggggtctttgctcagggcggactgggtgctcaggtagtggttgtcgggcagcagcacggggccgtcgccgatgggggtgttctgctggtagtggtcggcgagctgcacgctgccgtcctcgatgttgtggcggatcttgaagttcaccttgatgccgttcttctgcttgtcggccatgatatagacgttgtggctgttgtagttgtactccagcttgtgccccaggatgttgccgtcctccttgaagtcgatgcccttcagctcgatgcggttcaccagggtgtcgccctcgaacttcacctcggcgcgggtctt gtagttgccgtcgtccttgaagaagatggtgcgctcctggacgtagccttcgggcatggcggacttgaagaagtcgtgctgcttcatgtggtcggggtagcggctgaagcactgcacgccgtaggtcagggtggtcacgagggtgggccagggcacgggcagcttgccggtggtgcagatgaacttcagggtcagcttgccgtaggtggcatcgccctcgccctcgccggacacgctgaacttgtggccgtttacgtcgccgtccagctcgaccaggatgggcaccaccccggtgaacagctcctcgcccttgctcaccatctcgagatacagctccaccgcacatgccaccctccggatatattcgtctcgagcaaatcactcgagtatgtcgaggtggcgtgtacggtgggaggcctatataagcagagctcgtttagtgttggcagtctagcggctagcacgcgttgacattgattattgactagttattaatagtaatcaattacggggtcattagttcatagcccatatatggagttccgcgttacataacttacggtaaatggcccgcctggctgaccgcccaacgacccccgcccattgacgtcaataatgacgtatgttcccatagtaacgccaatagggactttccattgacgtcaatgggtggagtatttacggtaaactgcccacttggcagtacatcaagtgtatcatatgccaagtacgccccctattgacgtcaatgacggtaaatggcccgcctggcattatgcccagtacatgaccttatgggactttcctacttggcagtacatctacgtattagtcatcgctattaccatggtgatgcggttttggcagtacatcaatgggcgtggatagcggtttgactcacggggatttccaagtctccaccccattgacgtcaatgggagtttgttttggcaccaaaatcaacgggactttccaaaatgtcgtaacaactccgccccattgacgcaaatgggcggtaggcgtgtacggtgggaggtctatataagcatcgatatggctatgatggaggtccaggggggacccagcctgggacagacctgcgtgctgatcgtgatcttcacagtgctcctgcagtctctctgtgtggctgtaacttacgtgtactttaccaacgagctgaagcagatgcaggacaagtactccaaaagtggcattgcttgtttcttaaaagaagatgacagttattgggaccccaatgacgaagagagtatgaacagcccctgctggcaagtcaagtggcaactccgtcagctcgttagaaagatgattttgagaacctctgaggaaaccatttctacagttcaagaaaagcaacaaaatatttctcccctagtgagagaaagaggtcctcagagagtagcagctcacataactgggaccagaggaagaagcaacacattgtcttctccaaactccaagaatgaaaaggctctgggccgcaaaataaactcctgggaatcatcaaggagtgggcattcattcctgagcaacttgcacttgaggaatggtgaactggtcatccatgaaaaagggttttactacatctattcccaaacatactttcgatttcaggaggaaataaaagaaaacacaaagaacgacaaacaaatggtccaatatatttacaaatacacaagttatcctgaccctatattgttgatgaaaagtgctagaaatagttgttggtctaaagatgcagaatatggactctattccatctatcaagggggaatatttgagcttaaggaaaatgacagaatttttgtttctgtaacaaatgagcacttgatagacatggaccatgaagccagttttttcggggcctttttagttggctaaactagtggatccggctgtggaatgtgtgtcagttagggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatcacaattagtcagcaaccaggtgtggaaagtccccaggctccccagcaggcagaagtatgcaaagcatgcatctcaattagtcagcaaccatagtcccgcccctaactccgcccatcccgcccctaactccgcccagttccgcccattctccgccccatggctgactaattttttttatttatgcagaggccgaggccgcctcggcctctgagctattccagaagtagtgaggaggcttttttggaggcctaggcttttgcaaaaagcttgaattcgctgtctgcgagggccggctgttggggtgagtactccctctcaaaagcgggcatgacttctgcggccgc。