猪传染性胃肠炎病毒等温扩增技术快速检测试剂盒及检测方法

摘要

本发明涉及动物疫病分子生物学检测方法及检测试剂领域，具体涉及一种猪传染性胃肠炎病毒等温扩增技术(NASBA)快速检测用引物、试剂盒及其检测方法。本发明根据猪传染性胃肠炎病毒的基因序列，用ClustalW进行多重比对，分析序列的保守区，采用Primer5.0引物设计软件，分别设计引物和探针，可特异性的实现快速对猪传染性胃肠炎病毒的检测与鉴别。配制各种反应溶液组成相应的检测试剂盒。利用本发明的试剂盒具有作简便，特异性强、灵敏度高、可重复性高，且没有复杂的后处理，适用性广等优点。

主权项

猪传染性胃肠炎病毒等温扩增技术快速检测试剂盒，其特征在于：它包括NASBA‑Ⅰ和NASBA‑Ⅱ，可特异性的扩增猪传染性胃肠炎病毒，其中：所述NASBA‑Ⅰ包括NASBA扩增反应液管、NASBA反应酶Mix管、阳性对照管、阴性对照管和DEPC水管；NASBA扩增反应液管由以下反应液组成：序列为SEQ ID NO1的10 mmol/L的上游引物0.5 μL，序列为SEQ ID NO2的10 mmol/L的上游引物0.5 μL，NASBA  buffer缓冲液7.0 μL，1mmol/L的氯化钾溶液 1.2μL，DEPC水  0.8 μL，合计10 μL，为单次反应的用量；NASBA反应酶Mix管由以下反应液组成：T7 RNA 聚合酶10μL，终浓度为40U；AMV 16μL，终浓度为8U;RNase H 0.1μL，终浓度为0.2U;RNasin 5μL，终浓度为12.5UBSA 1.3μL,终浓度为2.6ug/μL，NASBA  buffer缓冲液17.6μL，合计50μL，为10次反应的用量；阳性对照管：为猪传染性胃肠炎病毒标准毒株的阳性重组质粒，体积20μL/管；阴性对照：管内为猪传染性胃肠炎病毒阴性的猪血清，体积50μL/管；DEPC水管：1mL～2mL；所述NASBA‑Ⅱ包括杂交缓冲液、探针混合液、检测浓缩液、显色液、终止液、10×TBST缓冲液和酶标板；探针混合液：包含100nmol/L通用探针SEQ ID NO3，100nmol/L检测探针SEQ ID NO4，体积比1:1。