一种复合菌株微生态制剂及其制备方法

摘要

本发明公开了一种复合菌株微生态制剂及其制备方法，分别采用酿酒酵母、枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌和凝结芽孢杆菌作为发酵菌种，在优化的固体培养基中，在合适的温度条件下培养，经过三级放大而进行大规模发酵生产，制剂中四种菌粉的质量比依次为：40-60:10-30:10-30:10-30。本发明有益效果：本发明生产工艺简单稳定，菌体密度高，发酵产物无需分离纯化便可直接使用，易于推广；将四种菌株发酵产物进行有机组合，以充分发挥各菌种的菌群优势，达到复配增效的目的，不仅能够预防消化道疾病，而且可以促进畜禽生长和增加体重，可以作为畜禽饲料添加剂使用。

主权项

一种复合菌株微生态制剂及其制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）菌种培养：① 菌种活化：本发明采用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)作为发酵菌种，酿酒酵母又称面包酵母或者出芽酵母，购于广东省微生物研究所菌种保藏中心，保藏号：CICC1795；酿酒酵母是与人类关系最广泛的一种酵母，传统上它用于制作面包和馒头等食品及酿酒，含有符合机体需求的优质蛋白质、膳食纤维、复合维生素和有机硒、铬、锌、铁等元素，是一种纯天然、无污染和绿色环保的健康营养来源；它的蛋白质含量较高，氨基酸平衡性好，消化吸收率高，将‑80℃保存的酿酒酵母菌种在YPD固体平板上划线，30℃培养16~24小时；② 制备一级种子：将活化的酿酒酵母菌种，用接种环挑取一环接种于200 mL YPD液体培养基中，将三角瓶置于摇床中，在温度为30℃和250rpm的条件下，振荡培养16~24小时后，制得一级种子菌；③ 配制固体发酵培养基：固体干基：以玉米粉和小麦粉为基础料（含有玉米粉40~60wt%）、葡萄糖2wt%、尿素0.5wt%、K2HPO4 1.0wt%和生物素0.01wt%；将固体干基加入质量比为1:1~2的无菌水，并在pH值为自然条件下搅拌均匀；将固体培养基在温度为121℃下，高温高压灭菌20min，待冷却后即可作为固体发酵培养基使用；④ 固体发酵：将经过灭菌处理的固体发酵培养基按照5~10%的接种量接入一级种子菌，搅拌均匀，保持湿度为50~70%、温度为25~30℃的条件下，培养20个小时左右，制得二级种子；⑤ 将得到的二级种子，按照步骤④进一步固体发酵得到三级种子；可以根据具体的培养用量，进一步将三级种子按照步骤④进一步固体发酵扩大培养；将酵母培养物进行菌落计数，要求活菌数达1.0×108cfu/g鲜曲以上；⑥ 将固体发酵的酵母蛋白培养物进行烘干干燥，然后粉碎和包装备用；（2）枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）菌种培养：① 菌种活化：    本发明采用枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）作为发酵菌种，购于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号，GIM 1.131，将‑80℃保存的枯草芽孢杆菌菌种在种子培养基（蛋白胨 10g，酵母提取物 5g，NaCl 10g，25%浓度MnSO4添加至0.2%，琼脂粉15g，加水至1升，高温高压灭菌备用）固体斜面上划线，37℃培养16个小时左右，活化；    ② 制备一级种子：    将活化的枯草芽孢杆菌，用接种环挑取一环接种于300 mL 液体种子培养基中（蛋白胨 10g，酵母提取物 5g，NaCl 10g，25%浓度MnSO4添加至0.2%，加水至1升，高温高压灭菌备用），将三角瓶置于摇床中，37℃，250rpm，振荡培养16~20小时后，制得一级种子液；    ③ 配制固体发酵培养基：    固体干基：以玉米粉、小麦粉和豆饼粉为基础料（质量之比为7:2:1），葡萄糖5.0%，CaCO3 1.5%，MnSO4·H2O 0.04%；将固体干基加入质量比为1:1~2的无菌水，pH值调为6.5，搅拌均匀；将固体培养基经121℃、20min高温高压灭菌，待冷却后即可作为固体发酵培养基使用；    ④ 固体发酵：将经过灭菌处理的固体发酵培养基按照8~10%的接种量接入一级种子菌，搅拌均匀，保持湿度为50~70%，温度为35~37℃培养16~20个小时，制得二级种子；将二级种子按照8~10%的接种量加入灭菌固体发酵培养基中进行扩大培养，搅拌均匀，保持湿度为50~70%，温度为35~37℃培养16~20个小时，制得三级种子；可以根据具体的培养用量，进一步将三级种子按照8~10%的接种量进一步扩大培养；将枯草芽孢杆菌培养物进行菌落计数，要求活菌体浓度可达1.0×109 CFU/g 鲜曲以上，芽孢形成率在90%以上；    ⑤ 干燥： 将枯草芽孢杆菌固体发酵培养物烘干、晾晒或者65℃下加温处理60min以内干燥，保存备用；（3）地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）菌种培养：  ① 菌种活化：    本发明采用地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）作为发酵菌种，将‑80℃保存的地衣芽孢杆菌菌种在种子培养基（胰化蛋白胨 10g，酵母提取物 5g，NaCl 10g，25%浓度MnSO4添加至0.2%，琼脂粉15g，高温高压灭菌备用）固体平板上划线，37℃培养18~20小时；    ② 制备一级种子：    将活化的酿酒酵母菌种，用接种环挑取一环接种于200 mL 液体种子培养基中种子培养基（胰化蛋白胨 10g，酵母提取物 5g，NaCl 10g，25%浓度MnSO4添加至0.2%，高温高压灭菌备用），将三角瓶置于摇床中，37℃，250rpm，振荡培养18~20小时后，制得一级种子液；    ③ 配制固体发酵培养基：固体干基：以玉米粉和豆饼粉为基础料（玉米粉与豆饼粉的质量之比为9:1），葡萄糖1.0%，尿素0.3~0.5%，NaCl 1.0%，将固体干基加入质量比为1:1~2的无菌水，pH值为自然条件，搅拌均匀；将固体培养基经121℃、20min高温高压灭菌，待冷却后即可作为固体发酵培养基使用；④ 固体发酵：将经过灭菌处理的固体发酵培养基按照8~10%的接种量接入一级种子菌，搅拌均匀，保持湿度为50~70%，温度为35~37.5℃培养18~20个小时，制得二级种子；将二级种子按照8~10%的接种量加入灭菌固体发酵培养基中进行扩大培养，搅拌均匀，保持湿度为50~70%，温度为35~37.5℃培养18~20个小时，制得三级种子；可以根据具体的培养用量，进一步将三级种子按照8~10%的接种量进一步扩大培养；将地衣芽孢杆菌培养物进行菌落计数，要求活菌体浓度可达1.0×109 CFU/g 鲜曲，芽孢形成率在80%以上；（4）凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）菌种培养： ① 菌种活化：本发明采用凝结芽孢杆菌（Bacillus coagulans）作为发酵菌种，保藏号：GIM 1.421，购于广东省微生物菌种保藏中心；将‑80℃保存的凝结芽孢杆菌菌种在种子培养基（胰化蛋白胨 10g，酵母提取物 5g，NaCl 10g，25%浓度MnSO4添加至0.2%和琼脂粉15g，经高温高压灭菌后备用）固体平板上划线，37~40℃培养20~24小时；② 制备一级种子：将活化的凝结芽孢杆菌，用接种环挑取三到五环接种于200 mL 液体种子培养基中，将三角瓶置于摇床中，在温度为37~40℃和250rpm的条件下，振荡培养20~24小时后，制得一级种子菌；③ 配制固体发酵培养基：固体干基：以玉米粉和豆饼粉为基础料（玉米粉与豆饼粉的质量之比为2:1）、KH2PO4 0.3~0.5wt%、MnSO4·H2O 0.02wt%和MgSO4·7H2O 0.125wt‰；将固体干基加入质量比为1:1~2的无菌水，并在pH值为自然条件，搅拌均匀，将固体培养基在温度为121℃的条件下，高温高压灭菌20min，待冷却后即可作为固体发酵培养基使用；④ 固体发酵：将经过灭菌处理的固体发酵培养基按照8~10%的接种量接入一级种子菌，搅拌均匀，保持湿度为50~70%和温度为37~40℃的条件下，培养20~24小时，制得二级种子；将得到的二级种子，按照8~10%的接种量进一步固体发酵得到三级种子；可以根据具体的培养用量，进一步将三级种子按照8~10%的接种量进一步固体发酵扩大培养；将凝结芽孢杆菌培养物进行菌落计数，活菌体浓度可达1.0×109 CFU/g 鲜曲以上，芽孢形成率在80%以上。