一种利用组织培养技术快速繁殖湖北贝母的方法

摘要

本发明公开了一种利用组织培养技术快速繁殖湖北贝母的方法，包括外植体的选择与消毒处理、材料的处理、愈伤组织诱导及芽分化、芽的增殖、愈伤组织的继代培养、生根培养、温室炼苗和移栽等步骤，经过上述处理，愈伤组织的形成率达到94%以上，增殖倍数超过了6.3倍，生根率达到了96%以上，最终的移栽成活率达到了94%以上，并且植株生长旺盛。并且在培育过程中把芽的增殖和愈伤组织的增殖分开来处理，这样提高了材料的利用率，提高了二者的成活率。

主权项

一种利用组织培养技术快速繁殖湖北贝母的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）外植体的选择与消毒处理：首先选用生长健壮、成熟的新鲜的湖北贝母鳞茎球，剥去鳞茎最外层干皱的鳞片和基部残余老根，先用自来水流水冲洗2‑3次，接着用50％利福平300倍液浸泡20‑30 min后用滤纸吸干水分，然后将鳞茎球一层一层的剥开，然后将剥开的鳞片转入到高压消毒的烧杯中，在超净工作台上先用75 %酒精浸泡杀菌30 s，去除酒精，用无菌水漂洗3‑4 次，再用2%次氯酸钠溶液消毒10min，无菌水冲洗2‑3次，迅速加入3 %双氧水浸泡杀菌8‑10 min ，浸泡过程中经常摇动烧杯，然后倒掉升双氧水液体，用无菌水冲洗4‑5 次后，再用无菌水浸泡备用；（2）材料的处理：将消毒处理好的鳞片用无菌滤纸吸干，在无菌条件下将鳞片按照上、中、下部还有基部，分别切成3‑5mm见方的小块，并且上、中、下部还有基部的材料分别进行下一步培养；（3）愈伤组织诱导及芽分化：在无菌的条件下将步骤（2）得到的外植体接种在愈伤组织诱导培养基中，该培养基是在在MS常规培养基中添加了0.6mg/L的6‑BA、0.8mg/L的GA3，80mg/L的蔗糖、10 g/L琼脂和0.4 mg /L的ZT；培养温度为26℃，光照时间13h/d，光照强度2200 Lx，PH为 6.5，经过10‑15天形成愈伤组织，也有部分直接分化出小细芽；（4）芽的增殖：将步骤（3）中直接分化出来的小细芽接种到3/4MS+琼脂6.0g/L+ NAA 0. 5mg/L + GA3 0.5mg/L+ ZT 0.2mg/L +蔗糖15g/L的培养基上，培养温度为25℃，光照时间12h/d，光照强度2 000 Lx，PH为 6.5，每瓶接种1个芽，8‑12 天后将诱导的丛生小鳞茎，将其中生长健壮、长势良好的小鳞茎转接至生根培养基，其余的小单芽再进行继代培养；（5）愈伤组织的继代培养：将步骤（3）中形成的愈伤组织和接种到1/2MS +6‑BA2.0 mg/L + GA3 0.5mg/L+ KT 0.5mg/L +蔗糖20g/L +琼脂5 g/L的培养基上，培养温度为25℃，光照时间12h/d，光照强度2 000 Lx，PH为 6.5，经过15‑20天长出小鳞茎；（6）生根培养：将经过步骤（4）和步骤（5）分化出来的小鳞茎一个个分别接种于下列诱导培养基中进行生根诱导：3/4MS培养基+琼脂8g/L +KT1.2mg/L +蔗糖20mg/L+活性炭2.0mg/L，培养温度为24℃，光照周期12h/d，光强度为2200lux，PH值为6.5，经过20‑25天待小鳞茎长至2‑3cm高，当根系比较健壮并且长出6‑10个根时，即开始下一个阶段；（7）温室炼苗和移栽：为了提高成活率，在移栽之前首先将培养瓶移至温室，温度在20‑25℃时炼苗一周，移栽时先在培养室内揭开培养瓶盖，取出用自来水冲洗去根部的琼脂，避免损伤根，然后用2000倍高锰酸钾浸泡2min，晾干后移栽到由腐殖土、蛭石、珍珠岩的混合比例为1∶2∶1的苗床上，为保持较高的湿度，每天喷雾2次，当长出新叶后，可视植株生长情况适当追施氮肥，经过10‑20天当植株长至4‑8cm高时移至大田，并且适当的进行遮荫处理。