棉花子叶瞬时表达外源基因的方法

摘要

一种棉花子叶瞬时表达外源基因的方法，由棉花种植、制备转化液、注射侵染、棉花培养、GUS基因表达检测步骤组成。本发明具有方便、快捷、易于操作、染色清晰等优点，适合检测棉花来源的外援基因的表达，亚细胞定位及启动子活性。

主权项

一种棉花子叶瞬时表达外源基因的方法，其特征在于它由下述步骤组成：（1）棉花种植棉花种子37℃浸泡12小时，将营养土与蛭石按质量比为3：1混合成栽培土，吸水8小时，待表面湿润后，种植棉花种子，覆土，25℃、湿度51±2%、16小时光照、8小时黑暗、光照强度24000lux的培养箱中培养至棉花种子萌发；（2）制备转化液吸取含有外源基因+GUS表达载体的农杆菌GV3101与LB液体培养基按1：50的体积比加入到LB液体培养基中，在LB液体培养基中加入50mg/mL的卡那霉素、50mg/mL的利福平、20mg/mL的庆大霉素，LB液体培养基与50mg/L的卡那霉素、50mg L/的利福平、50mg/L的庆大霉素的体积比为1：0.001：0.001：0.001，28℃，180转/分钟振荡培养15～18小时，制备成600nm的OD值为0.3～0.6的菌液，将菌液10000转/分钟离心1分钟，去除上清液，收集菌体，加入MS液体培养基和侵染液混匀，菌体与MS液体培养基、侵染液的体积比为1：90：10，得到转化液；上述外源基因用pCambia1301或pCambia2301或pBI121按常规的载体构建方法构建并转化进农杆菌GV3101中，外源基因与GUS基因连接成融合基因；上述的侵染液由100μmol/L的乙酰丁香酮与10mmol/L的硫酸镁的体积比为1：1混合制成；（3）注射侵染用蒸馏水清洁生长2～18天的棉花子叶，用质量浓度为75%的乙醇擦拭棉花子叶背面，用蒸馏水清洗残留的乙醇，在棉花子叶背面的两条叶脉分支处各注射30～150μl转化液，用蘸有蒸馏水的棉签清洁叶片背面；（4）棉花培养将注射侵染后的棉花植株放入24±1℃、光照强度24000lux、湿度51%的培养箱中，光照16小时，黑暗8小时培养24～96小时，在培养过程中GUS基因表达；（5）GUS基因表达检测将培养24～96小时的子叶用蒸馏水清洗，置于pH7.0的GUS染色液中，180转/分钟，37℃振荡染色24小时，浸泡在染色液中的棉花子叶用水循环式真空泵0.08MPa抽真空30分钟，继续振荡染色48小时，用乙醇脱色8小时，脱去叶绿素。