一种马泰勒氏虫病免疫印迹检测方法及试剂盒制备

摘要

本发明公开了一种马泰勒氏虫病免疫印迹检测方法及试剂盒，本发明马泰勒氏虫病免疫印迹检测方法，是以辣根过氧化物酶标记的羊抗马二抗结合物、化学发光底物在获得诊断抗原和阳性对照血清的基础上建立的；本发明方法试剂用量少成本低、特异性高、灵敏度高操作更快捷且无毒无害，所需条件低、试验结果易判定和长期保存，特异性比ELISA更强，用本发明检测均未发现假阳性和假阴性的结果。

主权项

一种马泰勒氏虫病免疫印迹检测试剂盒，包括马泰勒氏虫病免疫印迹诊断抗原，辣根过氧化物酶标记的羊抗马结合物，阳性对照血清、阴性对照血清，底物peroxide solution+Luminol enhancer solution，蛋白分子量标准标记物，4 ～12 % Bis‑Tris胶，硝酸纤维膜，MOPS  SDS Running Buffer，NuPAGE Antioxidant，转印缓冲液，磷酸盐缓冲液， 封闭液，洗液，感光胶片；其特征在于马泰勒氏虫病免疫印迹诊断抗原通过下述方法制备：（1）制备虫体培养用红细胞：将健康马血，离心处理后用VYM’s缓冲液洗涤、悬浮得到；（2）建立及扩大马泰勒氏虫体外培养：将感染马泰勒氏虫病马的抗凝血，经离心处理，用3x VYM’s缓冲液洗涤、悬浮获得染虫红细胞后，采用HL2A‑FBS组织培养液培养，当染虫率达到1.5%‑2%时即进行分代培养；当分代培养物染虫率超过2%时进行第一次扩大培养；之后每当染虫率达到3%或以上时即再次扩大培养；扩大培养环境为90%N2，5%O2，5%CO2；一个扩大培养周期为24 小时； （3）制备马泰勒氏虫病免疫印迹杂交诊断抗原：当步骤（2）培养物的染虫率超过5%时，收集培养物，经离心、洗涤，最后以PI buffer+1%NP40溶解至清亮，再加入 4x LDS sample buffer 、10x sample Reducing Agent，充分混匀，煮沸，迅速冷却，即得马泰勒氏虫病免疫印迹诊断抗原。