SHH/Lmx1a信号通路调控NTN修饰的rASCs分化多巴胺能神经元的方法

摘要

SHH/Lmx1a信号通路调控NTN修饰的rASCs分化多巴胺能神经元的方法，属于生物医学方法。本发明通过PCR分别获得Lmx1a基因和嵌合NTN基因的编码序列，经同源重组在HEK-293细胞中分别包装重组腺病毒Ad-Lmx1a和Ad-NTN。再将Ad-Lmx1a感染rASCs，用SHH/FGF-8等细胞因子将rASCs诱导至待命状态，再感染Ad-NTN，加入B27，N2supplement，bFGF等诱导剂。本发明显著提高rASCs向神经元细胞分化的潜能，相关转录因子能应用于帕金森氏病的未来细胞替代治疗中。

主权项

SHH/Lmx1a信号通路调控NTN修饰的rASCs分化多巴胺能神经元的方法，包括：（1）Lmx1a基因克隆和嵌合NTN基因克隆及重组质粒的构建（a)Lmx1a基因克隆及重组质粒以Lmx1a whole transcript cDNA（NM_138396）为模板，引物为：P1 up：5‑‘GCGTCGACGTACCATGCTGGACGGCCTAAAG‑3’，P1 down：5’‑CGGGATCCCGCTTATCAAGATGTGAAGTAAG‑3’，    通过PCR扩增获得带SalI和EcoR V酶切位点的DNA片段，将该片段插入pShuttle‑CMV中，通过Sal I和EcoR V双酶切鉴定，得到重组穿梭质粒pShuttleCMV‑Lmx1a；(b)嵌合NTN基因克隆及重组质粒人工合成含NGF信号肽和pro肽的基因；通过PCR搭桥将NTN的成熟肽基因与NGF信号肽基因和pro肽基因连接获得嵌合基因NGF/NTN，引物为：Ｐ2 up：５′ＧＧＡＡＧＣＴＴＡＣＣＡＴＧＴＣＣＡＴＧＴＴＧＴＴＣＴＡＣＡＣ３′，P2 down：５′ＴＴＧＡＴＡＴＣＴＴＡＣＡＣＧＣＡＧＧＣＧＣＡＣＴＣ３′回收纯化NGF/NTN的PCR产物，同时对纯化产物NGF/NTN和穿梭质粒pShuttleCMV进行双酶切，将NGF/NTN克隆至穿梭质粒pShuttleCMV启动子的下游，得重组穿梭质粒pShuttleCMV‑NGF‑NTN，将其转化至DH5α感受态，筛选阳性克隆；NTN营养支持保护（2）重组腺病毒的构建与包装将步骤（1）重组穿梭质粒pShuttleCMV‑Lmx1a和pShuttleCMV‑NGF‑NTN先后用PmeI线形化和CIAP进行5’去磷酸化，其产物经纯化后与腺病毒基因组pAdEasy‑1同时电转感受态细胞BJ‑5183，得同源pAdEasy‑1重组质粒，筛选阳性克隆；筛选出的pAdEasy‑1重组质粒经过鉴定后转化XL‑10(Gold),扩增、提取质粒，使质粒浓度达到0.1μg/μL，将质粒线性化后转染HEK‑293细胞，使重组腺病毒质粒在HEK‑293细胞中包装重组腺病毒Ad‑NGF/NTN和Ad‑Lmx1a，诱导10天，细胞病变，脱落形成串珠状，漂浮于上清液中；（3）rASCs向DA能神经元诱导（a）诱导前一天，取rASCs第二代细胞，接种于放有玻片且包被过多聚赖氨酸的六孔培养板，培养液为含10%FBS的L‑DMEM；（b）当细胞汇合率达95%时，以最佳MOI加入Ad‑Lmx1a感染rASCs，感染后换液为诱导液I进行预诱导，诱导3天后换液为含2%FBS的L‑DMEM，再以最佳MOI加入Ad‑NGF/NTN感染rASCs；（c）24h并确认rASCs都表达Lmx1a和NTN蛋白后，换液为诱导液II，每隔3天半量换液，直至21天，细胞发出细长的突触，相互连接最后交联形成网络状，神经元形态的细胞数量大量增多。