黄柄鹅膏与共生植物室内共生关系的建立方法

摘要

本发明涉及一种黄柄鹅膏与共生植物滇青冈室内共生关系的建立方法，属于生物技术领域（植物组织与真菌培养）。鹅膏菌绝大部分属于外生菌根真菌，目前尚不能进行人工栽培，难以开发利用，其子实体的生长发育与共生植物滇青冈等关系密切。本发明的特征为，利用黄柄鹅膏（A.flavipes）子实体诱导菌丝体，对菌丝体进行扩繁；利用野外采集的滇青冈(C.glaucoides)种子成功获得了无菌苗及盆栽苗，并将已扩繁的菌丝体分别接种到无菌苗及盆栽苗根部，接种苗比未接种苗生长健壮，叶数多，叶子浓绿，抗病性增强，创新性地建立了黄柄鹅膏与滇青冈的室内共生关系，为今后共生机理及鹅膏子实体发生的机制研究等提供了技术贮备。

主权项

一种黄柄鹅膏与共生植物滇青冈室内共生关系的建立方法，其特征为，利用黄柄鹅膏（Amanita flavipes）子实体诱导菌丝体，对菌丝体进行扩繁；利用野外采集的滇青冈(Cyclobalanopsis glaucoides )种子培养无菌苗及盆栽苗，将已扩繁的菌丝体分别接种到无菌苗及盆栽苗根部，室内建立共生关系，主要包括下列步骤：（1）黄柄鹅膏菌丝体的诱导及培养：野外采摘生长优良、无虫害、未开伞或未完全开伞、菌柄较粗壮、菌盖较肥厚的成熟子实体；将子实体带回实验室，于超净台上用酒精棉球，轻擦菌盖表面及菌柄等部位，除去表面泥沙或土，将子实体从菌盖中部一分为四，用解剖刀取菌柄与菌盖交接处的内部组织块，切成0.08～0.16cm2的小块；将以上切分的小组织块轻轻嵌入试管斜面诱导培养基表面，诱导培养基为：马铃薯200.00g/L、葡萄糖20.00g/L、NH4NO3 0.30～0.40g/L、谷氨酸 0.28～0.32 g/L、VB1 0.10mg/L、麦芽汁 150 ml/L、琼脂11.00g/L，控制pH值为5.4左右，培养温度为22～23℃，暗培养14～18天，菌块周围开始萌发出极少白色菌丝，53～60天，组织块多处隆起，表面长出团状、稠密的绒毛状白色菌丝；将以上诱导的菌丝转入培养皿中，用扩大培养基进行扩大培养，扩大培养基为：马铃薯100.00～120.00g/L、葡萄糖9.00～12.00g/L、过80～100目分样筛的滇青冈腐叶干粉30.00～50.00g/L、过80～100目分样筛的生境土干粉60.00～80.00g/L、蛋白胨 3.00～5.00 g /L、NH4NO3 0.60～0.80g/L、6‑BA1.20～1.50mg/L、麦芽汁200～230 ml/L、琼脂6.00～8.00 g/L，控制pH值为5.4左右；（2）滇青冈无菌苗的培养：于云南武定狮子山阔叶林中采集滇青冈种子；将种子放至清水中，洗净泥沙及污物，清除漂浮在水面上的烂种；将选出的种子自然干燥，把种皮剔除，挑选子叶中无明显菌斑的种子；将挑选后的种子放置于75%乙醇溶液中，摇晃浸泡30 s，取出种子，用无菌水清洗3次；将种子放置于0.1% HgCl2溶液中，摇晃浸泡10 min，取出种子，用无菌水清洗6～8次；将处理后的种子放置于无菌滤纸上滤干水分；将种子芽胚朝上接进萌发培养基，萌发培养基为：MS培养基，无糖，6‑BA 1.00～1.50mg/L，NAA 0.08 ～0.10mg/L，琼脂 7.50 g/L，pH为6.80，每瓶接种1颗，未污染的褐化种子于21～22℃下暗培养8～10天后生根开始萌发，转入2000～2500Lux的光照下相同温度再培养5～8天，长出1.8～2.3cm高的小苗时进行菌丝接种； （3）滇青冈盆栽苗的培养：将野外取回的生境土及腐叶在阳光下曝晒2～3天，放置于花盆中；将以上滤纸滤干水分的消毒种子埋入花盆中，种植深度3～4cm，浇水至透；每三天浇一次水，若土表过干隔天浇水；上午9：00以后将花盆置于室外自然光照下，晚上7：00左右将其移至室内保温；约25～30天种子发芽，待59～63天小苗长至4～5片真叶、高4～6cm时进行接种。