一种基于金磁微粒进行免疫沉淀反应的方法

摘要

本发明涉及一种基于金磁微粒进行免疫沉淀反应的方法，属于免疫沉淀领域，该免疫沉淀反应的方法是在生物样品中先加入抗体免疫沉淀反应后，再加进固定了蛋白A/G的载体分离，或在生物样品中加入固定了抗体的载体进行免疫沉淀反应后分离，其主要包括抗体的固定、免疫反应、洗脱步骤。它解决了现有免疫沉淀方法中有非特异性结合，可采用的抗体选择种类少，抗体活性损失大的问题，主要用来分离生物样本中的已知特定蛋白质的个别免疫沉淀法(IP)；用来研究整个蛋白质复合体；测定两种目标蛋白质是否在体内结合，确定一种特定蛋白质的新作用搭档的免疫共沉淀法(Co-IP)；用来研究与DNA结合的蛋白质的染色质免疫沉淀法(ChIP)；用来研究与RNA结合的蛋白质的RNA免疫沉淀法(RIP)等。

主权项

一种基于金磁微粒进行免疫沉淀反应的方法，其特征在于，它的实现步骤包括：（1）抗体的固定：选取金磁微粒作为反应的固相载体，将目标生物物质的特异性抗体直接偶联在金磁微粒的表面；所述将目标生物物质的特异性抗体偶联在金磁微粒表面的方法包括：（1.1）金磁微粒预处理：取金磁微粒，置于磁性分离器上，磁性分离，弃上清； 加入偶联缓冲液，轻摇重悬，置于磁性分离器上，磁性分离，弃上清，即得到预处理好的金磁微粒；（1.2）偶联抗体：取目标生物物质的特异性抗体，加入偶联缓冲液稀释，再加入至预处理好的金磁微粒中，置于摇床中，0～37℃条件下，充分反应10min～30min，磁性分离，弃上清；加入清洗缓冲液，轻摇重悬，磁性分离，弃上清；加入保存缓冲液，2～8ºC保存备用；（2）稀释目的生物样品：取目的生物样品，加入反应缓冲液稀释，保存备用；（3）免疫沉淀反应：（3.1）前处理：取上述步骤（1）中固定了目标生物物质的特异性抗体的金磁微粒，置于磁性分离器上，磁性分离，弃上清； （3.2）反应：加入上述步骤（2）中稀释好的目的生物样品，混合均匀，0～37℃条件下，充分反应5min～60min，磁性分离，弃上清，即为含有免疫沉淀复合物的磁性微粒复合物；（4）免疫沉淀复合物的洗脱：取上述步骤（3.2）中的磁性微粒复合物，加入洗脱缓冲液，混合均匀，0～37℃条件下，充分反应5min～60min，磁性分离，移取分离后上清，即为所需 的免疫沉淀复合物；所述基于金磁微粒进行免疫沉淀反应的方法还包括目标生物物质的特异性抗体的亲和配体的固定：步骤（1.2）中，在将目标生物物质的特异性抗体加入预处理好的金磁微粒中偶联之前，先加入目标生物物质的特异性抗体的亲和配体，0～37℃条件下，充分反应10min～30min，磁性分离，弃上清；再加入清洗缓冲液清洗，磁性分离，弃上清；所述基于金磁微粒进行免疫沉淀反应的方法还包括磁性微粒的再生和保存步骤：用再生缓冲液清洗上述步骤（3.2）免疫反应后的金磁微粒，将吸附到金磁微粒上的目标生物物质的特异性抗体从金磁微粒上洗脱下来，得到再生后的金磁微粒，再加入保存缓冲液，2ºC～8ºC保存备用；所述基于金磁微粒进行免疫沉淀反应的方法还包括金磁微粒的封闭步骤：在步骤（1.2）金磁微粒与目标生物物质的特异性抗体固定之后，步骤（3）免疫沉淀反应之前，先加入封闭剂，在0～37℃条件下，摇床中充分反应2h，磁性分离，弃上清；再加入清洗缓冲液清洗，磁性分离，弃上清，重复清洗至少三次。