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一种采用线粒体蛋白质组技术预测小麦杂种优势的方法，其特征在于按如下的步骤进行：（1）杂种F1获得：以农艺性状优良的栽培小麦京411为母本，抗白粉病小麦易位系Ta‑6DL/6VS为父本，进行杂交，获得杂交后代F1：京411（♀）×Ta‑6DL/6VS（♂）； （2）F1及双亲叶片线粒体分离：取新鲜幼苗叶片10g，用去离子水洗净，滤纸吸干，剪碎，加30mL匀浆液用组织捣碎机捣碎，用4层纱布过滤，收集滤液；4℃，5000rpm，离心15min，取上清液于4℃下36000rpm离心30 min， 弃上清液；沉淀用缓冲液A悬浮；4℃，5000rpm, 离心15min；再取上清液于4℃下36000rpm离心30 min，沉淀即为粗制线粒体；沉淀分别用4mL缓冲液A悬浮后加于蔗糖梯度20%、36%、52%和60%管上方，SW28水平转头，4℃下28,500 rpm, 超速离心2h；吸取36‑52%界面部分，溶于5倍体积的缓冲液A，并于4℃下42000rpm离心30 min，沉淀用预冷去离子水洗涤三次，即得纯净完整的线粒体；所述的匀浆液为含0.4 mol/L甘露醇，50 mmol/L Tris ‑ HC1，pH7.5，1.0mmol/L Na2EDTA，5.0mmol/L KCl，0.1% BSA, 2mmol/Lβ‑ 巯基乙醇；所述缓冲液A为：含0.4 mol/L甘露醇，50 mmol/L Tris‑HC1，pH 7.5，1.0 mmol/L Na2EDTA，5.0 mmol/L KCl；（3）线粒体蛋白的提取：在分离纯化的线粒体中加入4倍体积10%TCA ‑ 丙酮溶液（含0.07% β‑巯基乙醇）于‑20℃ 沉淀2小时；4℃，15,000 rpm，离心30min，弃上清液，沉淀用预冷丙酮悬浮，以去除杂质，在‑20℃沉淀1小时；4℃，12,000 rpm，离心10min，弃上清液，沉淀用预冷丙酮悬浮，在‑20℃沉淀1小时，重复3次；通过空气干燥或冻干去除残留的丙酮，在沉淀加入蛋白提取液，20℃ 下静置2h；20℃，15,000 rpm，离心30 min，上清液即为线粒体蛋白；所述的蛋白提取液指的是： 9.5M脲，2% NP40，1.6% Ampholine 5‑7，0.4 Ampholine 3‑10，5%β‑巯基乙醇；（4）预测小麦杂种优势的方法：将线粒体蛋白目标斑点从胶上切下，磨成粉末并用水清洗；凝胶用50 mM的碳酸氢胺与乙腈（体积比1：1）混合液清洗15分钟褪色，然后浸于100％乙腈中脱水10分钟，弃去乙腈，样品在真空干燥器中干燥15分钟；将干燥的凝胶粉末置于含50ng胰蛋白酶的25mM碳酸氢胺溶液中饱胀并于37℃孵育过夜；将凝胶用50％乙腈，5％三氟乙酸萃取收集肽段混合物；线粒体蛋白样品与用50％乙腈，0.1％三氟乙酸饱和的α‑氰基－3羟基肉桂酸以等体积混合，放于样品靶上；肽段质量用ABI4700仪器检测，质量精确度在10‑50ppm之间；肽质量指纹图谱（PMF）用MASCOT软件于NCBI数据库中进行检索，用上述质谱方法进行差异蛋白归属分析。 |
