人脐带间充质干细胞表达人2.5Sβ-神经生长因子及分离纯化的方法

摘要

本发明涉及一种STEMPRO MSC SFM无血清Cytolinel微载体培养技术，培养人脐带间充质干细胞(HUMSC)表达重组人2.5SβNGF和分离纯化人2.5SβNGF的方法。该方法采HUMSC表达系统表达2.5S-βNGF，采用等电点沉淀、CM-SepharosFF和SP-SepharoeHP层析三步联用法分离纯化。该方法与从小鼠颌下腺提取NGF或大肠杆菌表达系统表达NGF利用亲和层析、离子交换层析和疏水层析技术分离相比，具有生产规模大、产品纯度高、产品生物活性高和收率高、可避免异源性蛋白的污染等优点。

主权项

人体脐带间充质干细胞表达人体2.5Sβ‑神经生长因子及分离纯化的方法，包括如下步骤： 一、人脐带间充质干细胞的分离与培养： 1)取破宫产无菌脐带20‑40cm，置于无菌生理盐水瓶中，4‑6℃保存； 2)生物安全柜中清洗脐带血渍，将脐带剪成5‑7cm片段，剔除血管，PBS洗涤2‑4次； 3)将8‑12cm长的脐带转移到10cm的培养皿中，加入青霉素和链霉素，浓度分别为100单位/ml和100微克/ml； 4)将脐带剪成10mm3小块，加入10％I型胶原酶和透明质酸酶消化，工作浓度为0.1％，混匀，37℃消化4‑5h； 5)消化液用200目过滤，细胞悬液300G离心5分钟，收集细胞，接种于25T细胞瓶培养，温度37℃，饱和湿度，5％CO2； 6)3天后换液，除去未贴壁细胞，继续用STEMPRO MSC SFM培养； 二、传代扩增： 1)、原代细胞培养12‑14天后，培养瓶内细胞达到80‑90％生长面积，集落生长达到95％融合进行传代，P1代后90％融合后传代； 2)、弃培养基，PBS洗3次，0.5％胰蛋白酶‑EDTA消化40‑70秒； 3)、STEMPRO MSC SFM中和胰蛋白酶，离心收获细胞，STEMPRO MSC SFM分瓶培养传代； 三、冻存； 四、2.5Sβ‑NGF克隆、诱导分化与扩增： 1)、将带有2.5Sβ‑NGF基因、EGFP基因和新霉素抗性基因的慢病毒载体LV导入HUMSC干细胞干细胞培养基培养，经筛选、 鉴定后再诱导分化； 2)、在二甲基亚砜和细胞因子诱导下，HUMSC向神经细胞和神经胶质细胞分化；将HUMSCs在STEMPRO MSC SFM培养，加入神经条件培养基NCM中诱导成神经细胞，进一步诱导，最后得到12.7％的酪氨酸羟化酶TH阳性神经细胞； 五、HUMSC的扩增： 1)、一次性生物反应器小规模Cytoline1微载体培养：将诱导分化的细胞和微体进行小规模培养，Cytoline1微载体浓度为5克/L，待细胞浓度达到2×106后转入大规模培养； 2)、一次性生物反应器大规模Cytoline1微载体培养：将小规模培养的细胞换液，调整细胞密度至5×105cells/ml，加入间充质干细胞培养基和Cytoline1微载体，加入组合细胞因子SCF15ng/ml，FL5ng/ml，TPO6ng/ml，IL‑3 15ng/ml，G‑CSF1ng/mg，GM‑CSF5ng/ml，接种至生物反应器中，37℃、5％CO2、20％O2、饱和湿度条件下共同养12天；规模为每批5L，收获细胞总数约为5×1013个细胞； 六、2.5Sβ‑NGF的分离纯化： 1)、等电点沉淀：采用离心法将培养基和细胞分离，将培养基PH调至9.1，搅匀，室温静置2小时，离心分离沉淀，备用； 2)、CM‑SepharosFF和SP‑SepharoeHP层析分离：CM‑SepharosFF用2.5倍柱床体积的PH6.8，0.02MPB平衡，离心分离培养上清液经透析平衡后加入层析柱，流速50ml/h·cm2收集流出液，4℃酸化处理；再经SP‑SepharoeHP层析，温度4℃，离子交换层析分离纯化2.5SβNGF。