提高烟叶钾离子含量的烤烟种质培育方法

摘要

本发明公开了一种提高烟叶钾离子含量的烤烟种质培育方法，包括下列步骤：（1）按常规方法克隆烟草生长素诱导启动子Pcel7；（2）人工合成烟草钾离子外向通道TORK1、钾离子内向转运体NtHAK1和终止子Tnos的基因序列；（3）构建Pcel7驱动反义TORK1和CaMV35S驱动正义NtHAK1的双元植物表达载体pSH-C-T-35S-H；（4）转化土壤农杆菌和烟草外植体；（5）转基因烟株的分化、移栽和检测。本发明既通过生长素信号诱导减少了烟叶钾离子的外流，同时也增加了烟叶钾离子的摄取，从而有利于提高烟叶的钾离子含量。

主权项

一种提高烟叶钾离子含量的烤烟种质培育方法，包括下列步骤：（1）按常规方法克隆烟草生长素诱导启动子Pcel7：烟草生长素诱导启动子是烟草Cel7基因的启动子Pcel7序列，根据基因银行登记号：DQ156498.1中提供的Pcel7启动子的序列特点，设计和合成扩增引物，上游引物Cel7‑L引入SmaI酶切位点，下游引物Cel7‑R引入KpnI酶切位点，PCR克隆1.4 Kb的烟草生长素诱导启动子Pcel7；Pcel7启动子的扩增引物为：Cel7‑L：5’‑TCC CCC GGG TGC CCA TTC ATC AAG AAA‑3’； Cel7‑R：5’‑CGG GGT ACC TAT ACT TTT TTT GAT TTG‑3’； （2）人工合成烟草钾离子外向通道TORK1、钾离子内向转运体NtHAK1和Tnos终止子的基因序列:烟草钾离子外向通道基因TORK1为基因银行登记号: AB196792登录的完整基因序列；烟草钾离子内向转运体NtHAK1为基因银行登记号：DQ841950 登录的完整基因序列；烟草Tnos终止子序列为基因银行登记号：JN029690登录的NOS终止子序列；常规合成TORK1序列，以及合成两端依次添加XbaI和BamHI酶切位点的NtHAK1‑Tnos融合序列备用；（3）构建植物表达载体：将扩增的Pcel7启动子、人工合成的TORK1基因序列和NtHAK1‑Tnos融合序列分别连接到常规pGEM‑T easy 载体上构建出pGEM‑Cel7、pGEM‑TORK1和pGEM‑HAK1‑Tnos；用SmaI和KpnI双酶切pGEM‑Cel7和pSH737，把Pcel7小片段回收后构建到pSH737大片段上形成pSH‑C；用EcoRI单酶切pSH‑C和pGEM‑TORK1，把TORK1小片段回收后构建到pSH‑C大片段上形成pSH‑C‑T，筛选出TORK1的反向连接载体，从而得到生长素诱导启动子Pcel7驱动的烟草钾离子外向通道TORK1基因的反义植物表达载体pSH‑C‑T；用XbaI和BamHI双酶切pGEM‑HAK1‑Tnos和pSH‑C‑T，把HAK1‑Tnos小片段回收后构建到pSH‑C‑T大片段上形成pSH‑C‑T‑35S‑H，从而获得Pcel7驱动反义TORK1和CaMV 35S驱动NtHAK1的双元植物表达载体pSH‑C‑T‑35S‑H，转化Escherichia. coli TG1后保存菌种备用；（4）转化土壤农杆菌和烟草外植体将表达载体pSH‑C‑T‑35S‑H用冻融法转化到土壤农杆菌Agrobacterium tumefaciens LBA4404，挑取含有表达载体pSH‑C‑T‑35S‑H的农杆菌单菌落，在含100mg·L‑1 卡那霉素和20 mg·L‑1 利福平的YEP培养基中28℃振荡培养至OD600为0.5~0.7，6000rpm离心5min收集菌体，用重悬培养基重悬菌体；挑选鲜嫩的烟草外植体于重悬的菌液中浸泡10min，用无菌滤纸吸干菌液后转接于共培养基上，共培养2天后转入含头孢霉素 300mg·L‑1脱菌培养基上，保持选择压继代2次，直至脱菌完全；（5）转基因植株的分化、移栽将脱菌完全的外植体接于分化培养基上光照培养，光强为4000lux，14h/d；每20天继代一次，当分化的幼苗长至3~5cm时转移至生根培养基中培养，待苗长至5~10cm时打开瓶盖，炼苗3~5d后移植到土壤中。