一种定量检测土壤中大肠杆菌的方法及其检测试剂盒

摘要

本发明公开了一种定量检测土壤中大肠杆菌的方法及其检测试剂盒，该方法是在参考相关研究的基础上，采用MPN结合PCR的方法来定量检测土壤中的病原微生物。利用了PCR方法快速准确的优势，取代了传统MPN方法中阳性结果的生化鉴定和血清学鉴定等步骤，从而减少了国标方法中的繁琐步骤，提高了检测效率，同时也采用了国标法中的前增菌步骤，来提高检测目的病原菌的准确性，由于土壤自身的复杂性，土壤中存在着大量微生物，其中还包括不同名目的各种病原微生物，为了更好更准确地定量检测目的病原菌，采用了选择性培养目的病原菌来提高检测效率。经过发明人的创造性的努力以及科学实验验证，最终在土壤中添加纯菌实验中可以得到大肠杆菌定量检测方法的灵敏度为25个/g土壤。

主权项

一种定量检测土壤中大肠杆菌的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）取土壤，用无菌水稀释成5个稀释度，分别取5个稀释度的稀释样品1ml，控温30℃，用乳糖胆盐发酵培养基，摇床震荡培养24h，得增菌液；（2）取少量增菌液，隔水煮沸10min，常温静置30~40min使其充分复性，12000r/min离心1min，得上清液；（3）取2.5μL上清液作为PCR扩增模板，进行PCR扩增反应，引物序列为：phoA‑1：5’‑TACAGGTGACTGCGGGCTTATC‑3’，phoA‑2：5’‑CTTACCGGGCAATACACTCACTA‑3’；（4）同时扩增PCR产物、阳性对照和阴性对照，然后进行1%琼脂糖凝胶电泳，然后染色成像，与阳性对照比较，在684bp处出现特异性扩增条带者为阳性结果，不出现条带者为阴性结果；（5）统计阳性和阴性结果个数，查MPN表计算大肠杆菌个数；计算公式：活菌数/每克土=菌数近似值×数量指标第一位数的稀释度。