一种有效分离纯化肿瘤细胞中双微体的方法

摘要

本发明涉及一种有效分离纯化肿瘤细胞中双微体的方法，是通过染色体微切割结合DOP-PCR、FISH技术的优化实现对双微体简便、直观、高效、高纯度的分离和特异性的验证。首先在显微镜下找到肿瘤细胞染色体中期核型中的DMs将其从玻片上“刮”下来；经拓扑异构酶I处理，DOP-PCR技术扩增分离出来的DMs DNA；将DOP-PCR产物标记为探针，FISH技术与中期核型杂交，探针信号可特异性覆盖中期核型的所有DMs上。本发明的目的是提供一种双微体简单、高效的分离纯化方法，进而提供一种适用于多种肿瘤细胞中双微体分离纯化的方法，属染色体外DNA成分分离纯化技术领域。

主权项

一种有效分离纯化肿瘤细胞中双微体的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)选择含有双微体肿瘤细胞的实验材料(2)肿瘤细胞中期染色体标本制备在处于对数生长期的肿瘤细胞培养基中加入终浓度为0.05μg/mL的秋水仙素，37℃条件下继续培养一定时间，1000r/min离心8min收集细胞沉淀，弃上清，轻弹离心管底部将细胞制成悬液，加入9mL37℃预热的0.075mol/L KCl，37℃低渗约13min后，逐滴加入1mL新鲜配制的固定液，轻轻混匀悬液；1600r/min离心7min，弃去上清，加入固定液至10mL，1600r/min离心7min，再用新鲜配制的固定液将细胞沉淀洗两次，根据细胞沉淀的多少留1‑2mL的上清液制备细胞悬液并滴片，自然风干，Giemsa染液染色3～5min，晾干后于显微镜下进行染色体分析，观察细胞遗传学特征，并随机选取50个中期分裂相进行双微体计数，其中所述的固定液是甲醇与冰醋酸的体积比为3∶1；(3)染色体显微切割和DOP‑PCR将染色体悬液滴在盖玻片上，制备新鲜的染色体标本，37℃老化3天；Giemsa染色5min后空气干燥，37℃温育过夜；在光学显微镜下找到含有DMs的分裂相，用细玻璃针从肿瘤细胞中期分裂相中切割20个拷贝的DMs，转移至5μL含1U Topoiosomerase I的收集液中，37℃温预1h后，96℃变性10min，进行8个循环的预扩增，预扩增设定的条件为94℃ 1min，30℃ 2min，37℃ 2min，每个循环中30℃时加入0.3U Sequenase；8个循环后，在上述体系中加入50μL PCR混合物，PCR混合物为5μL 10×PCR buffer、5μL2mmol/L dNTPs、1μL 100μmol/L UN1引物、2U AmpliTaqLD酶、加ddH2O至50μL，进行DOP‑PCR一扩扩增，扩增条件为：94℃ 5min；94℃ 1min，56℃ 1min，72℃ 1.5min，30个循环；72℃ 5min；取2μL一扩产物配制DOP‑PCR二扩体系，包括5μL10×PCR buffer、5μL 2mmol/L dNTPs、1μL 100μmol/L UN1引物、2U AmpliTaqLD酶、加ddH2O至50μL，进行二扩扩增，扩增条件为94℃ 5min；94℃ 1min，56℃ 1min，72℃ 1.5min，设置为25个循环；72℃ 5min；(4)荧光原位杂交验证获得双微体的纯度和特异性①PCR反应标记荧光探针取二扩DOP‑PCR反应产物1uL，加入4uL Random primer，95℃ 10min在PCR仪上进行探针标记，然后取出立即放在冰上2min；再加入dNTP MIX1.6uL，加入Cy3‑dUTP或Green‑dUTP 3.2uL，加入Klenow fragment 0.2uL；37℃水浴避光孵育3h，然后加入1uL终止缓冲液；取标记好探针3uL，加入ssDNA 3uL，加入Cot I DNA 3uL，加入ddH2O 41uL，加入3mol/L pH5.2的乙酸钠5uL，混匀；加110uL‑20℃放置的预冷乙醇，混匀后‑80℃放置1h沉淀DNA，14000×g，4℃离心15min，弃上清，室温避光干燥5min，用9uL杂交液重悬标记好的探针，于37℃水浴溶解1‑2h；备用；②荧光原位杂交将已制备好并经过老化处理的中期染色体标本进行预处理，标本上每个样加100μL Rnase工作液，去除RNA，盖上盖玻片，放在湿盒中，37℃孵育40min；室温2×SSC洗3min；75％、85％、100％梯度乙醇脱水各3min，吹干；每个样加100μL胃蛋白酶工作液，盖上盖玻片，放在湿盒中，37℃孵育消化15min；然后用1×PBS洗涤5min；放入1％多聚甲醛溶液10min；再用1×PBS洗涤5min；75％、85％、100％梯度乙醇脱水，各3min，吹风机吹干，其中所述的Rnase工作液为10mg/ml Rnase用2×SSC稀释100倍；胃蛋白酶工作液为1％胃蛋白酶，用0.01N盐酸稀释200倍；探针在75℃变性5min，立即置于冰上2min，而后37℃水浴15min‑1h，进行预复性；将玻片放入预热的体积分数为70％的甲酰胺，75℃水浴变性3min；在4℃预冷的2×SSC中洗两次，每次洗3min；并在75％、85％、100％梯度的乙醇中脱水，各3min，吹干，进行中期染色体标本的变性，之后，在玻片待杂交区加10μL变性的探针混合物，立即盖上盖玻片，用rubber cement封片，玻片在湿盒内37℃杂交过夜，用镊子除去rubber cement封片剂；将玻片放入44℃水浴预热的体积分数为50％甲酰胺中，夹住玻片晃动，使盖玻片脱落，开始计时15min，即在甲酰胺中浸泡15min，然后放入2×SSC中洗两次，每次洗3min，75％、85％、100％梯度乙醇脱水各3min，吹干，加5μL DAPI复染，24mm×32mm盖玻片封片；避光保存或在荧光显微镜下观察并采集图像，用安装有CCD摄像头的荧光显微镜观察荧光信号，100倍镜拍照，Metamorphy软件采图。