酵母展示脂肪酶催化合成L-抗坏血酸DHA酯的方法

摘要

本发明公开了一种酵母展示脂肪酶催化合成L-抗坏血酸DHA酯的方法，包括：将L-抗坏血酸和DHA溶于有机溶剂中，加入酵母展示脂肪酶，无氧条件下于50～60℃反应4～8小时，分离、纯化制得L-抗坏血酸DHA酯；将经线性化处理的重组质粒转入毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115，将所得转化子接种于BMMY培养基中，诱导培养72～144小时后离心收集菌体，菌体经冲洗、生物印迹和冷冻干燥制得酵母展示脂肪酶；本发明通过将脂肪酶展示在细胞外，利用该酶制剂催化合成L-抗坏血酸DHA酯，不仅提高了转化效率，而且缩短了反应时间，降低了生产成本。

主权项

一种酵母展示脂肪酶催化合成L‑抗坏血酸DHA酯的方法，包括：人工合成米根霉（Rhizopus oryzae）的脂肪酶基因和毕赤酵母GS115的细胞壁α凝集素基因，接着在脂肪酶基因C端加上编码连接肽序列GSSGGSGGSGGSGGSGS的基因片段，连接得到核苷酸序列pro‑ROL‑linker‑α‑agglutinin，pro‑ROL代表脂肪酶基因，Genbank号为：AF229435，α‑agglutinin代表细胞壁α凝集素基因，Genbank号为：M28164，linker代表编码连接肽的基因片段；以人工合成序列为模板，利用以下引物对，进行PCR扩增；上游引物：5’‑AAGGAAAAAAGAATTCGTTCCAGTTTCTGG‑3’；下游引物：5’‑TTTTCCTTTTGCGGCCGCTAATGAAACG‑3’；PCR反应体系为：模板DNA为1μl，高保真DNA聚合酶0.5μl，50mM的dNTP0.4μl，上下游引物各0.5μl，10×PCR缓冲液5μl，加水至50μl；PCR运行条件为：94℃3分钟；35个循环，每个循环为：94℃30秒，60℃1分钟，72℃30秒；72℃10分钟；用EocR I和Not I同时酶切PCR产物和pPIC9K质粒，并在T4连接酶的作用下过夜连接形成pPIC9K‑ROL质粒，用Sal I对pPIC9K‑ROL质粒进行酶切线性化处理，将酶切线性化处理好的目的基因15μl加入到毕赤酵母GS115感受态细胞中，转入电转杯中，冰浴15min，然后在1500V，400Ω，25uF条件下电击10ms，并加入1mL预冷的山梨醇；将混匀的电转产物400μl涂于MD平板上，筛选阳性转化子，然后将阳性转化子涂于不同浓度的G418平板上，根据阳性转化子对G418的抗性筛选出Mut表型的多拷贝阳性重组菌株；将多拷贝阳性重组菌株接种在BMGY培养基中发酵培养30h，离心收集细胞；再将细胞置于含有体积百分比0.5%甲醇的BMMY培养基中诱导培养144h，离心收集细胞，用水冲洗后，接种至YGC培养基中30℃培养120h，然后3000g离心分钟收集菌体，蒸馏水洗涤后再用50mM pH7.0磷酸缓冲液洗涤，然后与2倍体积油酸混合，‑80℃下预冻后再经冷冻干燥机干燥24h，用己烷洗涤除去油酸，再进行再真空干燥去除己烷，即得到经生物印迹处理的酵母展示脂肪酶；取L‑抗坏血酸0.352g、DHA3.28g，加入含有5mL正己烷和5mL四氢呋喃的磨口三角瓶，混合、预热10min，然后加入酵母展示脂肪酶1g，充N2密封，置于85‑1型磁力搅拌器中搅拌开始反应，转速为200转/分钟，反应温度保持在50℃，反应6h后加入1.5g分子筛，分子筛的孔径小于2nm，继续反应12h后停止搅拌，离心沉淀除去酵母展示脂肪酶及分子筛，取上清液进行旋转蒸发除去四氢呋喃，水洗3次后加入正己烷于4℃结晶得L‑抗坏血酸DHA酯产品，烘干、粉碎。