一种硫酸软骨素二糖、四糖、六糖的制备方法

摘要

一种硫酸软骨素二糖、四糖、六糖的制备方法，属于食品技术领域。本发明以硫酸软骨素为原料，采用透明质酸酶降解制备得到硫酸软骨素寡糖，经G-25凝胶过滤分离、G-10脱盐、DEAE纤维素52阴离子交换色谱柱分离、天然制备凝胶电泳分离等，制备得到硫酸软骨素二糖、四糖及六糖。本发明涉及的一种硫酸软骨素二糖、四糖、六糖的制备方法，首次实现了三种硫酸软骨素寡糖的同时制备，为单一聚合度硫酸软骨素寡糖的工业制备提供了技术依据。

主权项

一种硫酸软骨素二糖、四糖、六糖的制备方法，其特征在于，以硫酸软骨素为原料，采用透明质酸酶降解制备得到硫酸软骨素寡糖，经G‑25凝胶过滤分离、G‑10脱盐、DEAE纤维素52阴离子交换色谱柱分离、天然制备凝胶电泳分离，制备得到硫酸软骨素二糖、四糖及六糖；具体步骤为：（1）硫酸软骨素的酶法降解将0.2 g硫酸软骨素溶解于10 mL pH 5.9的磷酸盐缓冲液中，置于37℃保温10 min，使其与反应温度达到一致，后向底物溶液中加入透明质酸酶HAase，使其酶活为1.4×105 u/L，以150转/分钟的振荡速度振荡反应22h‑24h；反应结束后，加热煮沸20min使酶失活，4000r/min离心15min，取上清液加3倍体积95%乙醇沉淀，静置，用10mL无水乙醇脱水3次，真空干燥得硫酸软骨素寡糖；（2）硫酸软骨素寡糖的凝胶过滤分离将处理好的Sephadex G‑25装成1.6×150 cm的玻璃层析柱，用去离子水将硫酸软骨素寡糖配制成40 mg/mL的溶液，上样量1 mL，用5倍柱体积的超纯水以4 mL/min流速洗脱，用分布收集器Redfrac 95定时自动收集，4mL/管，用咔唑反应检测糖醛酸含量以确定糖的出峰位置；（3）G‑10脱盐：收集到的样品40℃旋转蒸发浓缩后经过由Sephadex G‑10装成的1.6×150 cm层析柱脱盐分离以后，浓缩样品到50mL，再冻干，以捕获自由基能力为检测指标，筛选出抗氧化活性最高的硫酸软骨素寡糖，作为下一步分离对象；（4）硫酸软骨素寡糖的阴离子交换分离装柱：将浸泡好的DEAE纤维素52，沿玻璃棒缓慢加入到层析柱中2cm×20cm，避免胶中气泡产生，如果产生气泡，用玻璃棒轻轻搅拌，使气泡溢出，根据重力作用使凝胶慢慢沉降，并保持表面平整；预平衡：层析柱接好恒流泵后，用超纯水平衡柱子，以2mL/min的速率洗脱3‑5个柱体积至基线平稳；样品处理：将步骤（3）筛选出的硫酸软骨素寡糖用超纯水溶解至10 mL，上样到DEAE纤维素52阴离子交换柱；洗脱：上样1mL，用0‑1mol/L NaCl梯度洗脱75min，洗脱速率为2mL/min，210nm紫外检测；收集各洗脱峰；（5）硫酸软骨素二糖、四糖、六糖的天然制备凝胶电泳分离溶液配制：A液：硼酸0.1mol/L，Tris 0.1mol/L，乙二胺四乙二酸0.01 mol/L，加水溶解使pH8.3；质量浓度5%的浓缩胶：每100 mL浓缩胶含丙烯酰胺4.75 g、甲叉双丙烯酰胺0.25 g，并用盐酸调pH 6.3；每3mL浓缩胶加入10%过硫酸铵水溶液100μL，TEMED10μL；质量浓度35%的分离胶：每100 mL分离胶含丙烯酰胺31.82 g、甲叉双丙烯酰胺3.18 g和蔗糖15 g；每10mL分离胶加入10%过硫酸铵水溶液200μL，TEMED 20μL；分离胶和浓缩胶均用A液配制；电极缓冲液：甘氨酸1.25 mol/L，Tris 0.2 mol/L，加水溶解使pH 8.3；上样：将经DEAE‑52阴离子交换色谱分离的洗脱峰上样；电泳条件：室温，400V，4‑5h；染色：0.5%甲苯胺蓝溶于2%乙酸溶液中，染色10min；脱色：2%乙酸脱色；样品收集：样品脱色后，分别将电泳条带中含量最多组分剪下，捣碎，置于1mL PBS溶液中震荡，12h后离心，取上清液，置于4℃保存，沉淀继续置于1mL PBS溶液中震荡，重复三次后，将三次所得上清液过AKTA superdex peptide柱脱盐，冷冻干燥即得硫酸软骨素二糖、四糖、六糖。