重要呼吸道致病病毒检测基因芯片的制备和用途

摘要

本发明涉及一种重要呼吸道致病病毒检测基因芯片，其制备方法包括制备特异引物，制备病毒特异性探针，制备寡核苷酸芯片，建立RT-PCR体系，建立杂交体系，制备可视化检测试剂及建立显色方法。利用本发明制备的基因芯片可同时甄别9种常见呼吸道致病病毒，包括包括A、B型流感病毒，副流感病毒1、2型，人偏肺病毒，呼吸道合胞病毒，麻疹病毒，风疹病毒，腮腺炎病毒，为常见呼吸道致病病毒高通量、快速检测提供一种新的解决方案，可为呼吸道致病病毒的监测、临床诊断及治疗提供指导。

主权项

1.一种检测常见呼吸道致病病毒核酸的可视化基因芯片，可用于A、B型流感病毒、副流感病毒1、2型、人偏肺病毒、呼吸道合胞病毒、麻疹病毒、风疹病毒、腮腺炎病毒的检测，其制备方法包括： 1)步骤一： 制备9对呼吸道病毒特异性引物，分别放入3管RT-PCR体系中，序列如表1所示： 表1引物序列 2)步骤二： 制备9条病毒特异性探针，序列如表2所示： 表2病毒特异性探针序列 3)步骤三： 将步骤二中的各个寡核苷酸探针用6×SSC，0.1％SDS稀释至终浓度50μM，并点到空白的醛基化修饰玻片上，阵列如表3所示，其中片基质控探针为20T序列，5’端cy3标记、3’端氨基修饰，所有探针的点样量均为3nl，使用前至少在室温放置干燥18小时； 表3寡核苷酸探针阵列 片基质控 片基质控 片基质控 片基质控 片基质控 片基质控 片基质控 HMPV Meales Mump Rubella HRSV 片基质控 HMPV Meales Mump Rubella HRSV 片基质控 HMPV Meales Mump Rubella HRSV 片基质控 PIV1 PIV2 INFA INFB 空白对照 片基质控 PIV1 PIV2 INFA INFB 空白对照 片基质控 PIV1 PIV2 INFA INFB 空白对照 4)步骤四： 制备RT-PCR体系，配方如表4所示： 表4RT-PCR体系配方 5)步骤五： 制备杂交液，其组成为9×SSC，0.3％SDS，11％甲酰胺，11％50×Denhardt’s；制备洗液A，其组成为1×SSC，0.2％SDS；制备洗液B，其组成为0.2×SSC；制备洗液C，其组成为0.1×SSC； 6)步骤六： 制备可视化检测试剂，包括Streptavidin-HRP、Biotin-Tyramine、Streptavidin-Nanogold、稀释液、PBST洗液、银染试剂A液和B液，其中稀释液组分为1×PBS+0.1％BSA，PBST洗液组分为1×PBS+0.05％Tween20，银染试剂A液组分为醋酸银的水溶液，浓度4mg/mL，银染试剂B液组分为氢醌的柠檬酸缓冲液溶液，浓度10mg/mL。