以腺病毒为载体乳腺表达生产转基因蛋白药物的方法

摘要

本发明公开一种以腺病毒为载体乳腺表达生产转基因蛋白药物的方法。其特征是：利用复制缺陷型腺病毒骨架质粒载体携带不同种目标蛋白基因序列，在含有Ad5型腺病毒基因组E1A区序列的包装细胞系获得重组蛋白基因载体，在动物乳腺，获得瞬时高效表达的各种外源目标基因药物蛋白。操作步骤如下：(1)分离、克隆目标药物蛋白基因序列；(2)将所克隆目标蛋白基因与单标记筛选载体或双标记选择载体构成融合真核表达载体，体外真核细胞表达检测目标蛋白，获得体外表达正确的药物蛋白基因；(3)将所需目标蛋白基因与腺病毒基因组骨架分子重组，获得含重组目标药物蛋白基因的腺病毒载体；(4)将该重组目标药物蛋白基因腺病毒载体导入动物乳腺；(5)乳汁中分泌获得所需目标药物蛋白，获得高表达目标蛋白药物的动物。该乳汁中表达的重组蛋白可直接开发成各种保健品和药品，含有重组目标蛋白的动物奶也可直接开发成高附加值的保健奶及奶制品。

主权项

一种以腺病毒为载体乳腺表达生产转基因蛋白药物的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：(1)、分离、克隆目标药物蛋白基因序列：以pUC18、pUC19、pGEM‑3ZF、pShuttle、pcDNA3系列质粒为克隆载体，将目标蛋白hGH(人生长激素)的基因通过分子克隆，分别获得了含有目标基因的质粒系列载体；(2)、将所克隆目标蛋白基因与单标记筛选载体或双标记选择载体构成融合真核表达载体，体外真核细胞表达检测目标蛋白，获得体外表达正确的药物蛋白基因：以COS7(非洲绿猴肾细胞)、CHO(中国仓鼠卵巢细胞)、HEK293(人胚胎肾细胞)为宿主细胞对所构建的真核融合蛋白表达载体进行体外表达；Western Blotting、ELASA检测目标基因表达水平，获得了体外表达正确的所需蛋白药物基因；(3)、将所需目标蛋白基因与腺病毒基因组骨架分子重组，获得含重组目标药物蛋白基因的腺病毒载体：将所需目标基因接入穿梭载体，再与腺病毒基因组骨架质粒在细菌或真核细胞中重组，并在腺病毒包装细胞系生产出含有重组目标蛋白基因的复制缺陷型腺病毒载体；其中所述穿梭载体为pShuttle、pshuttle‑cmv、pDC311或pDC315，所用腺病毒骨架质粒为pAdeasy或pBHGlox(delta)E1.3Cre，所述腺病毒包装系细胞为911或HEK293；(4)、将该重组目标药物蛋白基因腺病毒载体导入动物乳腺：以重组目标蛋白基因的复制缺陷型腺病毒为载体，直接导入动物乳腺，使目标蛋白基因在乳腺上皮细胞内表达，利用乳腺上皮细胞基本特性，将目标蛋白分泌到动物乳汁中；(5)、从高表达目标蛋白药物的动物乳汁中分泌获得所需目标药物蛋白，其中所述动物为兔；其中，重组药物蛋白在动物乳汁中持续表达时间为10‑20天，目标蛋白表达量为2g‑8g/L。