快速高效筛选高产5-氨基乙酰丙酸突变菌株的方法

摘要

本发明公开一种可保证筛选准确度、减少筛选工作量，提高筛选效率的快速高效筛选高产5-氨基乙酰丙酸突变菌株的方法，是将一株类球红细菌通过物理或化学方法诱变处理后，无菌生理盐水洗涤，液体培养基重悬，32℃培养后，稀释菌悬液涂平板；从平板上挑单个菌落到无菌的96孔深孔板的对应孔中，32℃，黑暗，振荡培养48h，加前体和琥珀酸，再培养24h；ALA微量显色法（深孔板法）检测各孔菌液553nm分光光度值，数值最大的菌液为高产5-氨基乙酰丙酸突变菌株。

主权项

一种快速高效筛选高产5‑氨基乙酰丙酸突变菌株的方法，依次按照如下步骤进行：a. 将经过诱变处理的用以生产5‑氨基乙酰丙酸的类球红细菌（Rhodobacter sphaeroides）（CICC No:10278）用生理盐水洗涤，液体培养基重悬，32℃培养后稀释制成103~104个/ml的菌悬液，涂平板培养至生成菌落；b. 挑取菌落大而光泽鲜亮的单菌落接种于深孔板各孔中的液体培养基中培养36~48h，然后再向液体培养基中加入甘氨酸、琥珀酸和乙酰丙酸，加入量分别为甘氨酸15~45mmol/L，琥珀酸20~40 mmol/L，乙酰丙酸30~60mmol/L，继续培养24h；所述液体培养基为每升水中含有：葡萄糖 9.0g，谷氨酸钠3.8g，磷酸氢二钾0.5g，磷酸二氢钾0.5g，硫酸铵0.8g，硫酸镁0.2g，氯化钙0.053g，硫酸锰1.2×10‑3g，尼克酸1.0×10‑3g，VB1 1.0×10‑3g，酵母膏2.0g，生物素1.0×10‑5g；所述培养是在恒温微孔快速振荡器上，30~32℃，黑暗，振荡150~180r/min培养；c. 向每孔中加入0.1ml 1M的醋酸盐缓冲液和乙酰丙酮，乙酰丙酮在醋酸缓冲液中的质量浓度为1%，然后密封孔板，100℃水浴15min，再置于冰上冷却，冷却之后加入Ehrlich显色剂，室温15min后检测各孔菌液553nm分光光度值，数值最大的菌液为高产5‑氨基乙酰丙酸突变菌株。