一种有效硒生物检测用细胞株GpSEGFP4及其构建方法

摘要

本发明涉及有效硒生物检测用细胞株GpSEGFP4的构建方法，方法为一、pSECIS1载体的构建，1.1）pK6XhoI载体构建，1.2）pK6XhoI-CAT载体构建，1.3）pSECIS1载体构建，1.4）pSECIS突变载体构建，二、pCOLA-SelABC载体构建，2.1）pCOLA-SelC载体构建，2.2）pCOLA-SelABC载体构建，三、pSECIS突变体筛选，3.1）测定13种pSEICIS突变体及野生型的生长曲线，四、pET23a-SECIS-GFP载体构建，4.1)pET23a-SECIS-GFP载体构建，4.2)pET23a-SECIS4-GFP突变体构建。该方法能构建硒的检测器。

主权项

一种有效硒生物检测用细胞株GpSEGFP4的构建方法，其特征在于该细胞株的构建方法包括以下的步骤：一、pSECIS1载体的构建1.1）pK6Xho I载体构建定点突变pK6载体得到XhoI酶切位点，纯化产物并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，经测序验证得pK6XhoI载体；1.2）pK6Xho I‑CAT载体构建氯霉素抗性基因进行PCR扩增，PCR产物于琼脂糖凝胶中电泳，并割胶回收、纯化目的条带，用SmaI酶切pK6XhoI载体，纯化后与氯霉素抗性基因连接，经菌液PCR与测序验证得到pK6Xho I‑CAT载体；1.3）pSECIS1载体构建通过两次聚合酶链式反应扩增得到SECIS序列，模板依次为pK6Xho I‑CAT载体、第一次PCR产物纯化产物，将第二次PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测并纯化，用Xho I和Hind III分别酶切pCAT载体和SECIS 序列，纯化酶切产物并连接，经菌液PCR和测序验证得到pSECIS1载体；1.4）pSECIS突变载体构建对pSECIS1质粒进行定点突变，将纯化产物转化入大肠杆菌DH5α感受态细胞中，经测序验证得到13个正确的突变体；二、pCOLA‑SelABC载体构建2.1）pCOLA‑SelC载体构建PCR扩增SelC基因序列，纯化PCR产物并与pMD18T simple载体连接，测序验证得到pMD18T simple‑SelC，用Nde I、Kpn I分别酶切PCOLAduet‑1载体、sSelC质粒，琼脂糖凝胶电泳检测、割胶回收纯化、连接并转入DH5α感受态细胞，菌液PCR与测序验证得到pCOLA‑SelC载体；2.2）pCOLA‑SelABC载体构建扩增SelAB基因序列，PCR产物纯化、与pMD18T simple载体连接、转化到DH5α感受态细胞并测序验证得到pMD‑18T simple‑SelAB，BamH I 和Hind III双酶切 pCOLA‑SelC质粒与sSelAB基因序列，酶切产物电泳并割胶回收纯化、连接并转化入BL21感受态细胞，菌液PCR与测序验证得到pCOLA‑SelABC载体；三、pSECIS突变体筛选3.1）测定13种pSEICIS突变体及野生型的生长曲线从Chl平板上挑取突变的13种pSECIS及野生型菌种的单菌落，LB培养基培养过夜，用含氨苄青霉素和硒酸钠的LB培养基稀释菌液至OD600=0.05，37℃，振荡培养，测定1、2、3、4、5、6、7 h七个时间点的菌液OD600；记录分析在含硒和不含硒液体LB培养基中的生长繁殖速度；在不含硒的氨苄LB培养基中，只有不编码硒蛋白的野生型pSECIS14正常生长，其他的生长均非常缓慢且无明显区别；在0.5 mM硒酸盐存在的情况下，野生型pSECIS14生长速度与不加硒的生长类似，而pSECIS4的生长速度明显提高，基本是阳性对照野生型pSECIS14生长速度的一半左右，快于pSECIS1以及另外的SECIS突变；筛选获得pSECIS4突变体；四、pET23a‑SECIS‑GFP载体构建4.1) pET23a‑SECIS‑GFP载体构建三次PCR扩增SEGFP序列在GFP 5’端引入UGA/SECIS序列，模板依次为GFP基因、第一次PCR产物、第二次PCR产物；纯化PCR产物，第三次PCR产物末端加A，后纯化并与pMD18T simple载体连接，转化进入大肠杆菌DH5α，筛选并测序验证，得到pMD18T simple‑SECIS‑GFP载体；Nde I和Hind Ⅲ 分别酶切sSEGFP和pET23a并连接、转化，得到pSEGFP质粒并菌液PCR验证；4.2) pET23a‑SECIS4‑GFP突变体构建pET23a‑SECIS‑GFP质粒载体突变，将PCR产物纯化后转化进入DH5α感受态细胞并测序验证；提取pSEGFP4质粒并与pSelABC质粒共转化进入BL21感受态细胞获得GpSEGFP4。