肠道病毒71型感染荧光报告体系及其构建方法

摘要

本发明公开了一种肠道病毒71型感染荧光报告体系及其构建方法。以从流行株C4a--肠道病毒71型毒株SZ2010-EV71提取的RNA为模板，经RT-PCR 扩增得到全基因组序列，再采用重叠PCR技术，建立了带有绿色荧光蛋白GFP 报告基因的EV71感染荧光报告系统，恢复出的病毒可以传代扩增，操作简单；获得的病毒在感染细胞16-20小时就可以检测到明显的荧光，是一个高效、稳定、安全的细胞感染荧光报告体系，为针对及临近地域特异性EV71病毒的相关分子机制研究以及疫苗、药物的研发提供了一个简单、快速、灵敏的检测平台。

主权项

一种肠道病毒71型感染荧光报告体系的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)、以从肠道病毒71型毒株SZ2010‑EV71提取的RNA为模板，SEQ ID NO:2为引物，反转录得到cDNA；所述SZ2010‑EV71的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；(2)、以步骤(1)得到的cDNA为模板，以SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2为引物，PCR扩增得到肠道病毒71型的全基因组序列；(3)、将步骤(2)得到的肠道病毒71型的全基因组序列与载体连接，酶切，筛选得到阳性克隆，再将阳性克隆上的SnabI和SmaI酶切位点突变掉，使得插入的肠道病毒71型的全基因组序列上的SnabI和SmaI成为单酶切位点；(4)、以经步骤(3)处理的阳性克隆为模板，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:4为引物进行常规PCR扩增；以pEGFP‑C3质粒为模板，SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6为模板进行常规PCR扩增；以经步骤(3)处理的阳性克隆为模板，SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8为引物进行常规PCR扩增；回收混合PCR产物；(5)、以步骤(4)的PCR产物为模板，SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:8为引物进行overlapping‑PCR扩增，回收PCR产物；(6)、SnabI和SmaI双酶切经步骤(3)处理的阳性克隆和步骤(5)的PCR产物，连接，筛选阳性克隆，即为肠道病毒71型感染荧光报告体系。