分离反转录转座子长末端重复序列的方法

摘要

分离反转录转座子长末端重复序列的方法，以基因组DNA作为模版，利用RNaseH1引物分别与不同的退火控制引物组合进行第一次PCR反应，后通过第一次的PCR产物进行稀释，做为模板，使用RNaseH2引物与通用引物UP进行第二次PCR反应扩增，进行转化、质粒DNA的提取，进行序列测序，得到RNaseH酶的氨基酸序列，并编码蛋白。本方法相对于普通PCR技术具有操作简单，易直接瞄准反转录转座子长末端重复序列区,针对性强,与流式磁珠反向杂交法相比，免去杂交、洗脱、筛选等过程,流程简化，且效率高，与其它的分离方法相比，减少时间消耗、快速获得目的片段，在较短时间内将长末端重复序列克隆，减少假阳性率的发生。

主权项

一种从牡丹中分离Ty1‑copia类反转录转座子长末端重复序列的方法，其特征在于，分离方法为：步骤一、设计引物设计Rnase H组PCR引物、退火控制引物组PCR引物、UP通用PCR引物：巢式引物   RNaseH 1    MGNACNAARCAYATHGA           RNaseH 2    GCNGAYATNYTNACNAA退火控制引物 ACP 1    TGTAGCGTGAAGACGACAGAA IIIII VNVNNNGGAA ACP 2    TGTAGCGTGAAGACGACAGAA IIIII BNBNNNGGTT ACP 3    TGTAGCGTGAAGACGACAGAA IIIII HNVNNNCCAC ACP 4    TGTAGCGTGAAGACGACAGAA IIIII CAATGGCTACCAC ACP 5    TGTAGCGTGAAGACGACAGAA IIIII VVNVNNNCCAA ACP 6    TGTAGCGTGAAGACGACAGAA IIIII BDNBNNNCGGTUP 通用引物      TGTAGCGTGAAGACGACAGAA；所述的I 代表脱氧雌黄嘌呤，M=A/C，R=A/G ，Y=C/T，V=A/G/C，H=A/C/T，D=A/G/T，B=G/C/T，N=A/G/C/T；步骤二、牡丹基因组提取选取牡丹品种洛阳红的叶片，捣碎，利用提取DNA试剂盒提取基因组；步骤三、第一次PCR反应1）第一次PCR反应体系：在1.5ml的离心管A中配制20μl的PCR反应液Ⅰ，其成分为：浓度是100ng/μl的DNA基因组1μl、1μl含Mg2+的PCR 缓冲液、0.2μl的磷酸脱氧核糖核苷溶液、1μl的Taq DNA聚合酶、0.4μl的RNaseH 1引物和0.8μl的任意一条退火控制引物，余量为双蒸水，备用；2）第一次PCR反应程序：将配制好的PCR反应液Ⅰ，放于PCR仪内，进行PCR反应，反应程序为：94℃预变性5分钟，60℃退火1分钟，72℃延伸2分钟5个循环，94℃变性50秒，45℃退火30秒，72℃延伸2分钟1个循环，94℃变性50秒，55℃退火30秒，72℃延伸2分钟25个循环，72℃再次延伸8分钟，制得PCR产物Ⅰ，备用；步骤四、PCR产物Ⅰ的检测利用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物Ⅰ进行检测；步骤五、PCR产物Ⅰ的回收、纯化对检测后的PCR产物Ⅰ利用GenClean琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收、纯化，后用超纯水稀释100倍，备用；步骤六、第二次PCR反应1）第二次PCR反应体系：在1.5ml的离心管B中配制20μl的PCR反应液Ⅱ，其成分为：选取稀释后的PCR产物Ⅰ1μl、1μl含Mg2+的PCR 缓冲液，0.2μl的磷酸脱氧核糖核苷溶液，1μl的Taq DNA聚合酶，0.4μl的RNaseH 2引物和0.4μl的UP通用引物，余量为双蒸水，备用；2）第二次PCR反应程序：将配制好的PCR反应液Ⅱ，放于PCR仪内，进行第二次PCR反应，反应程序为：94℃预变性5分钟，94℃变性50秒，55℃退火30秒，72℃延伸2分钟30个循环，72℃再次延伸10分钟，制得PCR产物Ⅱ，备用；步骤七、PCR产物Ⅱ的检测利用琼脂糖凝胶电泳对PCR产物Ⅱ进行检测；步骤八、PCR产物Ⅱ的回收、纯化对检测后的PCR产物Ⅱ利用GenClean琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒进行回收、纯化，备用；步骤九、感受态细胞制备1）挑取大肠杆菌DH5α单菌落接种于LB培养基中，37 ℃培养16 小时，备用；2）取1 ml步骤1）中的培养物，加入到含有10 ml LB培养基的三角瓶中，在37℃条件下振荡培养至OD值为0.4～0.5，形成菌液，备用；3）取50μl的菌液至1.5 ml离心管C中，在0－4 ℃条件下冷却10分钟，放于冷冻离心机内，4 ℃条件下，转速4000 转/分钟离心10 min，弃去上层澄清液体，得到沉淀物Ⅰ；4）在沉淀物Ⅰ中加入0℃100 μl 0.1 mmol/L CaCl2溶液，混合均匀使细胞悬浮止，0℃条件下放置20 min，备用；5）取150μl含有沉淀物Ⅰ的CaCl2溶液移至1.5 ml离心管D中，在0－4 ℃条件下冷却10分钟，放于冷冻离心机内，4 ℃条件下，转速4000 转/分钟离心10 min，弃去上层澄清液体，得到沉淀物Ⅱ；6）在沉淀物Ⅱ中加入0℃100 μl 0.1 mmol/L CaCl2溶液，混合均匀使细胞悬浮止，0℃条件下放置20 min，备用；步骤十、转化1）在含有50－100μg/ml氨苄青霉素的LB平板培养基上，涂抹4 μl浓度为200 mg/ml的异丙基‑β‑D‑硫代半乳糖苷和40μl浓度为20 mg/ml的5‑溴‑4‑氯‑3‑吲哚‑β‑D‑半乳糖苷，后避光放置30—50分钟，备用；2）在0℃的1.5 ml离心管E加入50 μl感受态细胞和10 μl PCR产物II的连接反应液，混合混匀，0℃条件下放置30 分钟，备用；3）将1.5 ml离心管E放于42 ℃的水浴锅内，时间为90 分钟，取出，放于0℃冰水混合物中，时间为1－2 min，备用；4）在1.5 ml离心管D中加入400 μl液体LB培养基，放于振荡摇床中，37 ℃条件下，转速300转/分钟，振荡培养时间45－60分钟，形成混合液A，备用；5）取150μl混合液A，均匀涂布于LB固体培养基表层，37℃条件下倒置培养12－16小时，观察到蓝白相间的菌落，4℃保存备用；步骤十一、质粒DNA的提取1）用灭菌环挑选白色单菌落放入含有500 μg氨苄青霉素和5 ml LB液体培养基的50 ml离心管中，放于振荡摇床中，37 ℃条件下，转速300转/分钟，培养12－16小时，形成培养液备用；2）吸取1.0 ml培养液放于1.5 ml离心管F中，放于离心机内，转速12000 转/分钟，时间5min，弃去上层澄清液体，收集下层沉淀菌体A，加入的0℃的溶液Ⅰ100 μl，混合均匀使菌体悬浮，21℃条件下放置5分钟，备用；3）在1.5 ml离心管E中加入200μl溶液Ⅱ混合均匀，放与‑5℃条件下静置3—5分钟，备用；4）在1.5 ml离心管E中加入150 μl溶液Ⅲ，混合均匀，放与‑5℃条件下静置3—5分钟，后放于离心机内，转速12000转/分钟，离心5分钟，取上层澄清液体500μl至1.5ml离心管G中，备用；5）在1.5ml离心管G中加入0.5 μl 100μg/μl的RNA酶，21℃条件下放置30分钟，加入等体积的苯酚、氯仿、异戊醇的混合液，其中苯酚、氯仿、异戊醇混合液按体积比取25份的苯酚、24份的氯仿和1份的异戊醇，混合均匀，放入离心机内，转速12000转/分钟，离心5分钟，取上层澄清液体500μl放入1.5ml的离心管H中，备用；6）在1.5ml的离心管H中加入等体积的氯仿和异戊醇混合液，其中氯仿、异戊醇的混合液按体积比取24份的氯仿和1份的异戊醇，混合均匀，放入离心机内，转速为12000 转/分钟，离心2分钟，取上层澄清液体300μl放入1.5ml的离心管I中，备用；7）在1.5ml的离心管I中加入2.5倍体积的‑4℃无水乙醇，混合均匀，放入0℃的冰水混合物中15－30分钟，置于离心机内，转速为12000转/分钟，离心时间5分钟，弃去上层澄清液体，加入500μl的70％乙醇，浸泡5小时；8）弃去酒精，风干，在1.5ml的离心管I中加入灭菌的超纯水50μl进行溶解，－20℃储存，备用得到混合液B；步骤十二、阳性克隆菌检测利用第二次PCR过程中所使用的引物对混合液B再次做PCR反应，通过琼脂糖凝胶电泳进行检测，得到的质粒DNA，进行序列测定；得到Ty1‑copia类反转录转座子长末端重复序列，其基因序列如SEQ ID NO：1所示；后采用生物统计软件DNA Star 5.0推断RNaseH酶的氨基酸序列为：RTKHIDVRYHIVRDVIEKGDISLSKVHTNENPADMLTKVVTGSKIQHHLDLLH ISPC；其中所述的溶液Ⅰ由葡萄糖、Tris.HCl和EDTA组成，其中10ml溶液Ⅰ中按体积比取50 mM的葡萄糖、25 mM的Tris.HCl和10 mM的EDTA，余量为水；所述的溶液Ⅱ由NaOH和十二烷基硫酸钠组成，其中10ml溶液Ⅱ按体积比取0.2 M的NaOH和1%十二烷基硫酸钠，余量为水；所述的溶液Ⅲ由醋酸钾和冰乙酸组成，其中10ml溶液Ⅲ中按体积比取6ml的醋酸钾和1.15ml的冰乙酸，余量为水。