基因工程法制备重组谷胱甘肽过氧化物酶

摘要

本发明的基因工程法制备重组谷胱甘肽过氧化物酶属于生物技术的领域。先将靶基因组装到分泌型原核表达载体上，用基因突变法通过营养缺陷型原核表达系统或营养缺陷型和SPP低温联合表达系统，将GPX的催化基团SeCys引入到GPX的底物结合部位，结果赋予其高的GPX的活性；或者先将靶基因连同SeCys插入序列组装到分泌型哺乳类细胞表达载体上，再将SeCys插入序列结合蛋白2组装到胞内型哺乳类细胞表达载体上，将两种载体共转染同一哺乳细胞株，在亚硒酸钠存在下用哺乳细胞合成GPX。本发明方法简单，重组GPX活力和产量高、稳定性好，避免包涵体复性造成的产率下降和失活，从而解决天然GPX来源有限和性质不稳定问题。

主权项

一种基因工程法制备重组谷胱甘肽过氧化物酶GPX，是用营养缺陷型原核表达系统制备重组GPX，具体过程是，1）表达载体的构建：在保持氨基酸序列不变的前提下，根据基因文库中GPX基因序列设计引物扩增或直接合成其编码基因，确保GPX基因的5′端含有起始密码子，3′端含有终止密码子；用多克隆位点将GPX基因组装到分泌型原核表达载体上；在保持其它氨基酸序列不变的前提下，根据要突变为半胱氨酸的硒代半胱氨酸的位置和它比邻的氨基酸的基因序列设计完全等长互补的两条定点突变引物，以突变氨基酸的密码子为中心，引物长35‑50bp，用定点突变引物和快速定点突变试剂盒，将构建在原核表达载体上的GPX基因中的硒代半胱氨酸的编码序列突变成半胱氨酸的密码子；同样将GPX基因中的其它半胱氨酸突变成丝氨酸；通过DNA测序确定突变成功，且无其它意外基因突变发生；所述的多克隆位点，是载体上固有的由多个核酸限制性内切酶识别的碱基组成的DNA序列；2）阳性转化子的筛选及蛋白的表达与纯化：将含有突变的GPX基因的载体转化营养缺陷型菌株‑BL21(DE3)Cys的感受态细胞，涂含半胱氨酸的营养琼脂平板，筛选阳性转化子；将阳性转化子扩培养后，在含有硒代半胱氨酸、必需生长因子和营养素的培养基里，经异丙基硫代‑β‑D‑半乳糖苷诱导，营养缺陷型菌株‑BL21(DE3)Cys能用半胱氨酸的密码子合成硒代半胱氨酸，最后直接表达出在底物谷胱甘肽的结合部位含有硒代半胱氨酸的GPX，酶蛋白以可溶性形式表达并分泌到菌体的周质腔里；先小量培养筛选高表达株，再扩大培养和诱导表达；收集、洗涤、冰浴下超声破碎菌体、释放酶蛋白，将液体低温离心，去除菌体沉淀、获得上清液；用谷胱甘肽亲和层析纯化GPX，透析冻干后即得酶蛋白纯品。